靶向VEGF165多模態(tài)分子成像探針制備與體內(nèi)外靶向成像研究

尤曉光，彭明麗，涂蓉，文麗君

1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 海口 570102；2. 西北大學(xué)，陜西 西安 710127；3. 海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571100

引言

腫瘤血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是維持腫瘤血管生長和增殖的關(guān)鍵生長因子，廣泛存在于惡性腫瘤中，分布于腫瘤細(xì)胞和腫瘤鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)外，通過細(xì)胞膜上受體發(fā)揮作用。VEGF165是體內(nèi)最多的亞型，其生物活性最強(qiáng)，故在臨床和科研中應(yīng)用最多[1]。VEGF165能直接刺激腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，使得VEGF165成為重要的腫瘤顯像與治療靶分子。適配體（Aptamer）是具有特異性蛋白結(jié)合功能的單鏈寡核苷酸片段，VEGF165-Aptamer是可特異性識別和結(jié)合VEGF165的適配體，其序列由27個(gè)堿基組成[2]。由于其結(jié)構(gòu)靈活易變，三維構(gòu)象復(fù)雜，很容易形成與靶標(biāo)結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)，所以理論上能與VEGF165靶分子結(jié)合。CY5.5的發(fā)光在近紅外區(qū)，背景非常低，易于標(biāo)記蛋白質(zhì)、適配體等靶向物質(zhì)，特別適合于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像研究。

Lim等[3]將αvβ3-Aptamer與超順磁性氧化鐵（Ultrasmall Superparamagnetic Iron Oxide，USPIO）連接構(gòu)建 Apt αvβ3-MNPs磁性納米粒，對肝癌小鼠模型顯示出較好的T2負(fù)性強(qiáng)化效果。Fan等[4]用人類表皮成長因子受體2（Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，HER2）特異性CY3-Aptamer標(biāo)記USPIO，從SK-BR-3乳腺癌患者血中成功分離出乳腺癌細(xì)胞，并被熒光及MRI成像證實(shí)。Wu等[5]將前列腺癌膜抗原PSMA特異性Aptamer與USPIO連接，體外對前列腺癌PC3細(xì)胞顯示出明顯的T2負(fù)性靶向強(qiáng)化作用。Cui等[6]合成RGD-PAA-USPIO，對鼻咽癌移植瘤抗血管生成治療效果監(jiān)測，治療后4天與14天，實(shí)驗(yàn)組觀察到腫瘤T2負(fù)性靶向強(qiáng)化，隨著時(shí)間延長，腫瘤縮小，而對照組T2負(fù)性強(qiáng)化不明顯。我們采用化學(xué)交聯(lián)法將USPIO與CY5.5-VEGF165-Aptamer進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，得到靶向性磁性納米微粒CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO，并進(jìn)行活體內(nèi)外靶向?qū)嶒?yàn)，與上述實(shí)驗(yàn)相比，我們選用的靶點(diǎn)VEGF165在活體內(nèi)腫瘤分布更廣泛，VEGF165-Aptamer分子量更小，體內(nèi)無免疫源性，因此本靶向?qū)Ρ葎┙窈蟾信R床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)鑒定其理化性質(zhì)，觀察其體外對腫瘤VEGF165靶點(diǎn)的靶向結(jié)合能力，同時(shí)觀察其體內(nèi)MRI及熒光靶向腫瘤顯像效果，為今后其攜帶阿霉素或多柔比星等化療藥用于腫瘤治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CY5.5-VEGF165-Aptamer（由大連寶生物工程有限公 司 合 成 ），VEGF165（ProSpec-Tany TechnoGene Ltd），抗 -VEGF165（1:500-1000，Millipore Corporation），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG（1:500-1:2000，Millipore公司）。顯色液A、B，終止液（英科新創(chuàng)科技有限公司），洗滌液為磷酸鹽緩沖液（PBS，PH值為7.4），96孔酶標(biāo)板（Sigma)，酶標(biāo)儀（Thermo Scientific Corporation，MK3型），USPIO（西北大學(xué)），EDC與NHS（Thermo Fisher Scientific Inc），普魯氏藍(lán)染色試劑盒（Solarbio），BEL-7402荷瘤鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），3.0T MRI（GE），小動(dòng)物熒光成像儀（IVIS Lumina II in vivo Imaging System）。

1.2 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO探針構(gòu)建

取 1.5 mg USPIO（50 μL）加入 200 μL EDC（5 mg/mL）與200 μL NHS（5 mg/mL），37℃活化30 min；磁分離后向離心管中加入CY5.5-Aptamer 1 mg，PBS（pH=8.0）調(diào)整液體總體積500 μL，37℃避光偶聯(lián)3 h；再次磁分離后加入1%甘氨酸封閉磁株，放入4℃冰箱備用。

1.3 CY5.5-Aptamer-USPIO與VEGF165體外結(jié)合能力的ELISA實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分三組：空白對照組、實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組?？瞻讓φ战M5只2.5 mL離心管中放入0.25 mL CY5.5-USPIO，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組加入與之等量CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO。將空白對照組與實(shí)驗(yàn)組加入相同量的VEGF165，陰性對照組加入與之等量VEGF121，37℃搖床內(nèi)反應(yīng)1 h；磁分離后每管內(nèi)加入等量VEGF165一抗50 μL，37℃搖床內(nèi)反應(yīng)30 min；再次磁分離后每管內(nèi)加入等量VEGF165二抗50 μL，37℃搖床內(nèi)反應(yīng)30 min；最后磁分離后每管內(nèi)加入顯色A液200 μL與B液200 μL，37℃搖床內(nèi)反應(yīng)10 min后每管內(nèi)加入終止液200 μL，移液器從每管內(nèi)吸出50 μL液體放入96孔酶標(biāo)板中，450 nm測吸光度（Optical Density，OD）值，OD=l g(1/trans)，其中trans為檢測物的透光值。

1.4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)靶向熒光成像實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分兩組，實(shí)驗(yàn)組與對照組。實(shí)驗(yàn)組與對照組均為8只腋下BEL-7402肝癌荷瘤鼠。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO 0.2 mL；對照組尾靜脈給予CY5.5-USPIO 0.2 mL（與實(shí)驗(yàn)組等劑量、等摩爾濃度）。分別在注射對比劑后進(jìn)行間斷多時(shí)（1、2、3、4、6h）點(diǎn)掃描，檢測每次成像采集的腫瘤熒光強(qiáng)度并進(jìn)行記錄，觀察對比劑在腫瘤內(nèi)的結(jié)合情況及代謝時(shí)間記錄。在熒光強(qiáng)度峰值時(shí)間采集熒光成像后處死實(shí)驗(yàn)組2只、對照組1只荷瘤鼠，行免疫組化及普魯氏藍(lán)染色檢查。

1.5 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)MRI靶向?qū)嶒?yàn)

實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分兩組，實(shí)驗(yàn)組和對照組各8只腋下BEL-7402肝癌荷瘤鼠。掃描參數(shù)為軸位FSE T2WI：TR 400 ms，TE 102 ms；矩陣：192×192；FOV：8 cm×8 cm；層厚：0.8 mm；層間距：0。對比劑增強(qiáng)給藥方式：麻醉方法，采用戊巴比妥1.0～1.25 mg/20～25 g，即0.05 mg/g（荷瘤鼠），每次掃描前10 min給藥。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO 0.3 mL（1.5 mg/mL），對照組尾靜脈注射等量CY5.5-USPIO。共掃描3次，分別在注射前平掃、注射后3 h與6 h掃描。信號強(qiáng)度的測量方法為分別在各時(shí)段同層面取三個(gè)感興趣區(qū)（Region of Interest，ROI）求平均值，每個(gè)ROI直徑約2.0 mm。

1.6 免疫組化

取腫瘤組織脫水、包埋、切片、脫蠟后，接著熱修復(fù)。用pH=9.0檸檬酸緩沖液放在微波爐中火煮沸約10 min，然后自然冷卻至室溫；然后加VEGF165一抗1:4000，4℃過夜；取出玻片復(fù)溫，從4℃冰箱內(nèi)拿出玻片后復(fù)溫10 min，PBS浸洗后加VEGF165二抗，37℃孵育30 min；最后PBS液浸洗三次后，使用DAB顯色試劑盒的顯色劑A、B各一滴，加至標(biāo)本上，顯色5～10 min，充分水洗后，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，再次充分水洗，待玻片干后，中性樹脂封片。

1.7 普魯氏藍(lán)染色

取腫瘤組織脫水，包埋、切片、烤片、脫蠟，然后在玻片上滴加鹽酸與亞鐵氰化鉀等量混合液染20～30 min，蒸餾水洗3遍；接著中性紅溶液染1.5～2 min，自來水沖洗；最后脫水，二甲苯透明2 min兩次，中性樹脂封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件及Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)組與對照組均為計(jì)量資料，不同組間采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 探針構(gòu)建結(jié)果

CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO構(gòu)建示意圖，見圖1。CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO粒徑小于30 nm（圖2），磁飽和度為35 emu/g（圖3）。CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO熒光發(fā)射光譜，見圖4，其最大發(fā)射波峰在707 nm附近。

圖1 USPIO經(jīng)EDC與NHS活化后將CY5.5-VEGF165-Aptamer包被于其表面，構(gòu)建成CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO

圖2 透射電鏡示CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO粒徑小于30 nm

圖3 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO飽和磁化強(qiáng)度

圖4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO磁性納米顆粒水溶液的熒光發(fā)射光譜

2.2 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體外與VEGF165體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為確認(rèn)與USPIO偶連的CY5.5-VEGF165-Aptamer能特異、高效地與VEGF165結(jié)合，我們設(shè)計(jì)了本ELISA實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CY5.5-VEGF165-Aptamer僅能與VEGF165結(jié)合，而不能與VEGF121結(jié)合，USPIO沒有與VEGF165結(jié)合的能力（見表1與圖5）。

2.3 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPI體內(nèi)靶向熒光實(shí)驗(yàn)

腋下肝癌實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后腫瘤熒光信號逐漸上升，3 h信號達(dá)最大值，然后信號逐漸下降，6 h接近平掃（圖6）。對照組腫瘤未見明顯熒光，未見明確強(qiáng)化。

表1 ELISA實(shí)驗(yàn)展示不同組在450 nm處獲得的OD值 （±s）

表1 ELISA實(shí)驗(yàn)展示不同組在450 nm處獲得的OD值 （±s）

注：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理為LSD-t檢驗(yàn)，F(xiàn)=474519.233，組間兩兩比較的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組號 組名 OD值 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組比 P 1 空白對照 0.800±0.001 1:2 P＜0.001 2 實(shí)驗(yàn)組 2.311±0.002 2:3 P＜0.001 3 陰性對照組 0.803±0.004 1:3 P = 0.099

圖5 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體外與VEGF165體外結(jié)合ELISA實(shí)驗(yàn)

圖6 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO活體熒光成像圖

2.4 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO體內(nèi)靶向MRI實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明荷瘤鼠尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后，在3 h T2WI上信號較平掃明顯降低，6 h信號已經(jīng)回升與平掃無顯著差異；對照組鼠尾靜脈注射CY5.5-USPIO后，不同時(shí)間點(diǎn)掃描，T2WI信號無明顯差異（圖7和圖8）。免疫組化及普魯氏藍(lán)染色結(jié)果，見圖9。腫瘤細(xì)胞漿VEGF165免疫組化染色陽性，呈棕黃色；部分腫瘤細(xì)胞漿見藍(lán)色鐵沉積，染色陽性。

3 討論

利用Aptamer構(gòu)建靶向探針是近年來頗受重視的一個(gè)研究方向，與抗體相比，核酸類配基更優(yōu)越，如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復(fù)性可逆，可修飾并易于長期保存和室溫運(yùn)輸[7-8]。利用酰胺鍵將CY5.5標(biāo)記到VEGF165-Aptamer表面，合成時(shí)3'端帶有一游離氨基供與羧基USPIO連接，其中Aptamer是一種小分子的寡核苷酸，其序列由27個(gè)堿基組成，序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是5'-CGGAAUCAGUGAAUGCUUA UACAUCCG-3'，所有的嘧啶（C，U）為核糖環(huán)2'位被氟修飾（2'-F-C或2'-F-U），所有嘌呤（A，G）用核糖環(huán)2'位被甲基修飾（2'-O-CH3-A或2'-O-CH3-G），在自然環(huán)境下不被RNA酶降解。由于其結(jié)構(gòu)靈活易變，三維構(gòu)象復(fù)雜，很容易形成與靶標(biāo)結(jié)合的口袋結(jié)構(gòu)。其識別分子的模式與抗體類似，但比抗體具有更高的特異性，能識別VEGF165的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[2]。

圖7 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO活體MRI成像圖

圖8 CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO SNR統(tǒng)計(jì)圖

圖9 免疫組化及普魯氏藍(lán)染色圖

細(xì)胞高表達(dá)靶分子是分子成像的基礎(chǔ)，由于VEGF165廣泛分布于多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)外，通過細(xì)胞膜上VEGFR2受體發(fā)揮作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高血管的通透性，誘導(dǎo)新生血管的形成。腫瘤細(xì)胞不僅分泌VEGF165，同時(shí)還能表達(dá)其受體[9-10]。因此，VEGF165能直接刺激腫瘤細(xì)胞的增殖，但在生理情況下VEGF165表達(dá)水平很低，僅在胚胎組織與增殖期子宮內(nèi)膜有適量的表達(dá)，因而是構(gòu)建分子探針的理想靶點(diǎn)[11-12]。USPIO表面攜帶羧基，經(jīng)EDC與NHS活化后可與CY5.5-Aptamer游離氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定連接體，成為靶向性對比劑合成基礎(chǔ)[13-14]。

評價(jià)藥物靶向投遞系統(tǒng)的一個(gè)重要研究內(nèi)容是分子探針對其病變部位的選擇性，即靶向性[15]。靶向性使藥物在活性部位有更高的濃度，從而降低藥物劑量，減少毒副反應(yīng)。為了檢測CY5.5-VEGF165-Aptamer與VEGF165體外特異性結(jié)合能力，我們構(gòu)建了ELISA實(shí)驗(yàn)，CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO上連接的VEGF165-Aptamer只能與VEGF165結(jié)合而不能與生長因子VEGF121結(jié)合。由于空白對照組USPIO表面沒有與VEGF165結(jié)合的對應(yīng)物質(zhì)，因此空白對照組與實(shí)驗(yàn)組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這更進(jìn)一步說明在我們設(shè)計(jì)的ELISA實(shí)驗(yàn)中，CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO與VEGF165的結(jié)合是特異性靶向性的結(jié)合。為了驗(yàn)證CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO在活體內(nèi)對VEGF165的靶向性，我們建立了BEL-7402腋下荷瘤鼠模型，并分成實(shí)驗(yàn)組鼠尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO，對照組鼠尾靜脈注射等量CY5.5-USPIO。體內(nèi)熒光靶向?qū)嶒?yàn)顯示，腋下肝癌實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO后腫瘤熒光信號逐漸上升，表明CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO逐漸積聚靶向BEL-7402腫瘤，3 h信號最大值，然后信號逐漸下降，6 h接近平掃，強(qiáng)化作用消失，對照組未見明顯強(qiáng)化。MRI掃描發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠腫瘤在3 h T2WI信號較平掃明顯降低，與熒光成像吻合，6 h T2WI信號已經(jīng)回升與平掃無顯著差異；對照組平掃、3 h、6 h各時(shí)間點(diǎn)T2WI信號變化不大；實(shí)驗(yàn)組腫瘤確實(shí)存在明顯負(fù)性強(qiáng)化，并被普魯氏藍(lán)染色證實(shí)（圖9）。腫瘤區(qū)VEGF165是我們靶向成像的靶點(diǎn)，其由腫瘤細(xì)胞分泌出胞外，經(jīng)間質(zhì)移向新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激腫瘤新生血管形成及腫瘤細(xì)胞增殖（免疫組化證明瘤區(qū)VEGF165染色陽性，見圖9），隨著生物學(xué)功能完成而被解離代謝（動(dòng)態(tài)過程）。實(shí)驗(yàn)組在3 h出現(xiàn)明顯強(qiáng)化，說明此時(shí)CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO已經(jīng)與瘤區(qū)VEGF165靶點(diǎn)結(jié)合，6 h負(fù)性強(qiáng)化作用消失，說明此時(shí)與CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO結(jié)合的VEGF165可能被代謝解離，與之結(jié)合的CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO失去了這個(gè)游動(dòng)的靶點(diǎn)，重新返回腫瘤血管進(jìn)入體循環(huán)被代謝。對照組USPIO表面沒有與VEGF165特意性結(jié)合的VEGF165-Aptamer，因此不可能與瘤區(qū)靶點(diǎn)結(jié)合，始終不存在強(qiáng)化效應(yīng)。Huang等[16]合成anti-VEGF-conjugate@IO多功能靶向MRI探針，內(nèi)結(jié)合Fe3O4及多柔比星抗癌藥，表面標(biāo)記VEGF抗體，靶向瘤區(qū)生長因子；尾靜脈給藥后1 h，腋下肝癌模型小鼠腫瘤出現(xiàn)T2負(fù)性強(qiáng)化，12 h強(qiáng)化達(dá)峰值，24 h瘤區(qū)仍見靶向負(fù)性強(qiáng)化存在。我們合成的靶向?qū)Ρ葎?qiáng)化峰值在給藥后3 h、6 h負(fù)性強(qiáng)化作用消失，與Huang等[16]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比，強(qiáng)化峰值時(shí)間較早，體內(nèi)代謝較快，這可能與對比劑體內(nèi)與靶點(diǎn)結(jié)合方式不同及對比劑粒徑大小等特性有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示通過化學(xué)方法構(gòu)建CY5.5-VEGF165-Aptamer-USPIO多模態(tài)靶向分子探針，體外可靶向結(jié)合VEGF165，體內(nèi)可以VEGF165為靶點(diǎn)靶向MRI及熒光顯像；但活體內(nèi)是否存在毒性及其大小，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。