麝香通心滴丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠頸總動(dòng)脈形態(tài)及hs-CRP的影響*

陳晶晶 賀 粵 趙東升 周亞濱 孫 靜 王淑榮△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省沭陽(yáng)縣中醫(yī)院，江蘇 沭陽(yáng) 223699；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 1500400；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

冠心病穩(wěn)定性心絞痛（SAP）發(fā)病率與死亡率在逐年上升［1］，防治冠心病刻不容緩。冠心病穩(wěn)定型心絞痛的發(fā)生機(jī)制包括很多，其中炎癥機(jī)制占有主導(dǎo)地位，反應(yīng)炎癥的指標(biāo)有很多，例如纖維蛋白原和超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2（Lp-PLA2）。多年來(lái)結(jié)合文獻(xiàn)與臨床研究筆者發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致胸痹心痛的“瘀”“熱”“毒”與炎癥因子導(dǎo)致冠心病的現(xiàn)代研究相一致。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察麝香通心滴丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型hs-CRP、Lp-PL-A2的影響，以及動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型頸總動(dòng)脈的形態(tài)學(xué)變化，探討麝香通心滴丸可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)別的SD大鼠80只，均為雄性，體質(zhì)量180～200 g，大鼠于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)得，生產(chǎn)動(dòng)物許可證：SYXK（黑）2016-004。大鼠在通風(fēng)的及定期紫外線照射的環(huán)境下喂養(yǎng)，將大鼠分籠，室內(nèi)物品嚴(yán)格消毒。室內(nèi)溫度控制在（25±1）℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%。普通飼料組成：碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%和脂肪10%、其他8%。高脂飼料組成：普通飼料81%、豬油3%、黃15%和膽固醇1%。以上成分混合均勻再進(jìn)行壓粒即可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼料。

1.2 藥物與試劑 麝香通心滴丸（每丸重35 mg，批號(hào)140623），實(shí)驗(yàn)前用研缽將藥品研成細(xì)末，用0.9%氯化鈉溶液配成所需濃度，藥液濃度為36.5%。瑞舒伐他汀鈣片（每片重5 mg，批號(hào)H20080240）。實(shí)驗(yàn)前用研缽將藥品研成細(xì)末，用0.9%氯化鈉溶液配成所需濃度，藥液濃度為8.6%。垂體后葉素（1 mL/支×10支，出廠自南京新百藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)H32026638），以上藥品都購(gòu)買自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診。Lp-PL-A2測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 318W型洗板機(jī)，上海三科儀器有限公司；高速離心機(jī)，日本日立集團(tuán)；電子秤，香山EK813股份有限公司；電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.4 造模與分組 60只大鼠參考文獻(xiàn)［2］，采用腹腔注射垂體后葉素制備模型。在1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，于尾靜脈處采血，檢測(cè)血脂水平有無(wú)異常。隨機(jī)取15只作為空白對(duì)照組，將剩余的45只大鼠進(jìn)行造模每天喂養(yǎng)高脂飼料 （81%普通飼料，3%的豬油，1%膽固醇，15%蛋黃），喂養(yǎng)32 d后，連續(xù)3 d予腹腔注射垂體后葉素30 U/（kd·d）。在空白對(duì)照組中隨機(jī)抽取3只大鼠，在進(jìn)行造模的45只大鼠中隨機(jī)抽取9只大鼠，用10%水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行腹腔內(nèi)注射以麻醉，靜脈采血檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)血脂中的低密度脂蛋白與三酰甘油，均較空白對(duì)照組增加。取出的頸總動(dòng)脈，在光鏡下顯示：不規(guī)則動(dòng)脈管腔及內(nèi)膜增厚，紊亂的平滑肌排列，彈力膜斷裂，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積在管周，細(xì)胞輕度炎性浸潤(rùn)，提示造模成功。除去空白對(duì)照組及死亡的大鼠，造模成功的大鼠隨機(jī)分成3組，即模型對(duì)照組（n=10）、中藥治療組（n=10）、西藥對(duì)照組（n=10）。除空白對(duì)照組予普通飼料（碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪10%、其他8%）外，其余各組均予高脂飼料（81%普通飼料，3%的豬油，1%膽固醇，15%蛋黃）。

1.5 給藥方法 按標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量成人（70 kg）、標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量大鼠（200 g）及折算系數(shù)為0.018按照劑量公式進(jìn)行劑量換算，具體用藥劑量如下，空白對(duì)照組：予西藥對(duì)照組及中藥治療組用藥同體積的蒸餾水10 mg/kg，每日1次灌胃。模型對(duì)照組：予西藥對(duì)照組及中藥治療組用藥同體積的蒸餾水10 mg/kg，每日1次灌胃。中藥治療組：麝香通心滴丸溶液 10.94 mg/（kg·d）灌胃。 西藥對(duì)照組：瑞舒伐他汀鈣片溶液 0.52 mg/（kg·d）灌胃。持續(xù)給藥8周，自由進(jìn)食水。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 在第8周后，將各組SD大鼠禁食12 h后，予10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用剪刀剃掉大鼠頸部的毛，常規(guī)消毒之后，沿頸總動(dòng)脈到頸正中線旁3 mm處作1個(gè)平行切口（頸動(dòng)脈切口位置：胸骨與下頜連線），沿著胸骨上7 mm處起，向上垂直延伸約15 mm處切開(kāi)皮膚，充分暴露頸前肌群，在頸直肌和頸斜肌交叉處，可看見(jiàn)或明顯觸摸強(qiáng)烈搏動(dòng)的頸總動(dòng)脈，隨后剝離頸總動(dòng)脈肌膜，從伴行呈白顏色的神經(jīng)以及頸靜脈中游離出長(zhǎng)度大約15 mm的頸總動(dòng)脈，注意防止損傷神經(jīng)，之后用線條將遠(yuǎn)心端結(jié)扎，再將近心端動(dòng)脈用血管鉗夾住，在頸總動(dòng)脈兩端的中間插管取血，注意動(dòng)脈釆血過(guò)程中，導(dǎo)管中要注入肝素鹽水，肝素濃度推薦為10～15 U/mL。1）取各組大鼠中動(dòng)脈血，在離心機(jī)上以3 600 r/min速度，進(jìn)行10min分離血清，再采用乳膠凝集比濁法，對(duì)hs-CRP進(jìn)行測(cè)定。2）按試劑盒說(shuō)明，采用雙抗體夾心法檢測(cè)標(biāo)本中Lp-PL-A2水平。用純化的Lp-PL-A2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Lp-PLA2，再與HRP標(biāo)記的Lp-PL-A2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，在徹底洗滌之后加入TMB顯色。HRP酶催化底物TMB使之變?yōu)樗{(lán)色，與此同時(shí)酸將底物TMB變?yōu)辄S色。顏色的深淺和標(biāo)本中的大鼠Lp-PL-A2呈正比。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀吸光度（OD值），用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中Lp-PL-A2濃度。3）剝離出頸總動(dòng)脈，將上面殘血用0.9%氯化鈉注射液洗凈，再用10%的多聚甲醛溶液使標(biāo)本牢固，用乙醇逐級(jí)脫水，覆蓋石蠟進(jìn)行包埋切片，參照常規(guī)方法用HE進(jìn)行染色來(lái)觀察頸總動(dòng)脈內(nèi)膜的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較 見(jiàn)表1。與模型對(duì)照組相比，空白對(duì)照組、中藥治療組、西藥對(duì)照組血清hs-CRP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與西藥對(duì)照組相比，中藥治療組血清hs-CRP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型對(duì)照組相比，空白對(duì)照組、中藥治療組、西藥對(duì)照組Lp-PLA2水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與西藥對(duì)照組相比，中藥治療組Lp-PL-A2水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較（x±s）

表1 各組大鼠hs-CRP、Lp-PL-A2水平比較（x±s）

與模型對(duì)照組治療后比較，△P＜0.05

組 別 n Lp-PL-A2（μg/L） hs-CRP（mg/L）空白對(duì)照組 10 6.19±2.56△ 1.76±0.45△模型對(duì)照組 10 12.60±4.74 4.30±0.86中藥治療組 10 7.11±2.83△ 2.80±0.73△西藥對(duì)照組 10 6.85±2.38△ 2.70±0.53△

2.2 各組大鼠頸總動(dòng)脈病理形態(tài)觀察 見(jiàn)圖1?？瞻讓?duì)照組大鼠頸總動(dòng)脈結(jié)構(gòu)完整，具有清楚的層次，有光滑、連續(xù)，的內(nèi)膜，中層的平滑肌層分布均勻沒(méi)有萎縮，動(dòng)脈管腔近圓形，有不規(guī)則增厚，彈力膜較清晰，局灶平滑肌排列紊亂，輕度腫脹；模型對(duì)照組的動(dòng)脈血管壁內(nèi)皮脫落，內(nèi)膜有明顯的增厚，內(nèi)皮下的間隙增寬，內(nèi)彈力板斷裂，中膜平滑肌有明顯萎縮，管周有泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積，炎細(xì)胞輕度浸潤(rùn)；中藥治療組的內(nèi)皮細(xì)胞有部分的脫落，結(jié)構(gòu)較完整，只有少量的脂質(zhì)沉積，并且內(nèi)彈力板斷裂少見(jiàn)；西藥對(duì)照組主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)鏡下顯示與麝香通心滴丸組相似。

圖1 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠頸總動(dòng)脈病理形態(tài)（HE染色，200倍）

3 討 論

3.1 麝香通心滴丸組方分析及現(xiàn)代藥理研究 麝香通心滴丸主要成分為人工麝香、人參、蟾酥、丹參、人工牛黃、熊膽粉和冰片［3］。方中麝香、蟾酥為君，活血止痛；人參莖葉總皂苷、丹參為臣，補(bǔ)氣活血，與麝香、蟾酥配伍以行氣血不暢之標(biāo)，補(bǔ)心氣不足之本；佐以人工牛黃、熊膽清熱解毒、豁痰開(kāi)竅；冰片為使，與麝香等配伍，增強(qiáng)清熱開(kāi)竅止痛之功?？傆[全方，補(bǔ)氣活血止痛，清熱化痰開(kāi)竅，標(biāo)本兼顧。本研究結(jié)果表明，麝香通心滴丸能夠減低動(dòng)脈粥樣硬化大鼠hs-CRP及抑制Lp-PL-A2，同時(shí)保護(hù)心肌細(xì)胞不受損害，所以我們認(rèn)為它的機(jī)制可能是因?yàn)轺晗阃ㄐ牡瓮璋l(fā)揮活血清熱、化痰開(kāi)竅的功效，活血化痰清熱，病邪乃去，則能治療動(dòng)脈粥樣硬化?，F(xiàn)代藥理研究顯示麝香可以抑制氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化，具有增強(qiáng)心肌收縮力，增大收縮幅度，改善內(nèi)皮功能等作用，對(duì)心肌起到保護(hù)作用［4-5］?，F(xiàn)代藥理研究表明人參能抑制心肌肥厚，增加血流量，營(yíng)養(yǎng)心肌，人參皂苷能降低游離鈣離子，促進(jìn)一氧化氮、環(huán)磷鳥(niǎo)苷的生成舒張血管［6-7］。蟾酥能保護(hù)心肌，降低心肌收縮力，其有效成分蟾酥靈能抑制鈣誘導(dǎo)鈣釋放［8］。丹參能保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，提高SOD活性，減少細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)OX40/OX40L信號(hào)通路抗動(dòng)脈粥樣硬化［9-10］。人工牛黃對(duì)心衰模型心臟有正性肌力作用，其主要成分?；撬峥梢砸种蒲“迥⒀ǖ纳杀Ｗo(hù)心肌、抗心力衰竭［11-12］。熊膽粉能ECV304細(xì)胞的損傷，其有效成分熊去氧膽酸及?；蛆Z去氧膽酸能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［13］。冰片能夠抑制炎性因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，控制血栓的形成［14］。

3.2 麝香通心滴丸對(duì)hs-CRP及Lp-PL-A2表達(dá)的影響 hs-CRP是一種重要的微量蛋白質(zhì)分子，它由肝臟合成、釋放，是判斷炎癥反應(yīng)急性期的重要指標(biāo)［15］。hs-CRP與病情輕重呈正相關(guān)，所以檢測(cè)hs-CRP對(duì)各種炎性疾病、機(jī)體受到創(chuàng)傷及心血管疾病有重要的價(jià)值［16］。Lp-PL-A2也是近年來(lái)備受熱議的炎癥標(biāo)志物，它又稱為血小板活化因子乙酰水解酶，可催化脂蛋白和細(xì)胞膜上的甘油磷脂二位?；ユI水解，最終形成非酯化脂肪酸及溶血磷脂［17］，這兩種物質(zhì)均是促炎促凋亡的脂質(zhì)調(diào)節(jié)物，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞聚集至血管內(nèi)皮細(xì)胞下，促使白細(xì)胞黏附因子等多種炎癥因子的表達(dá)，損傷動(dòng)脈內(nèi)膜，促進(jìn)并參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展［18］。本研究結(jié)果表明，麝香通心滴丸能明顯抑制動(dòng)脈粥樣硬化大鼠心肌組織hs-CRP及Lp-PL-A2的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，治療動(dòng)脈粥樣硬化，其與瑞舒伐他汀療效相當(dāng)。

3.3 麝香通心滴丸對(duì)頸總動(dòng)脈形態(tài)的影響 頸動(dòng)脈因其解剖位置表淺，利于取材觀察，并且它病變的程度和冠狀動(dòng)脈平行，已經(jīng)成為臨床觀察外周動(dòng)脈的首選指標(biāo)［19］。頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)主要改變有二，一為頸動(dòng)脈內(nèi)膜中膜復(fù)合體厚度（IMT）增厚，二為斑塊形成，其常常作為最重要的評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一，冠心病患者頸動(dòng)脈IMT及斑塊指數(shù)比健康人群明顯升高［20］，并且冠狀動(dòng)脈病變程度越重，則頸動(dòng)脈IMT及斑塊指數(shù)越高。本研究通過(guò)光鏡觀察頸總動(dòng)脈形態(tài)，一方面為了判定動(dòng)脈粥樣硬化模型復(fù)制是否成功，高脂飼料喂養(yǎng)32 d后，腹腔注射垂體后葉素3 d，采血測(cè)低密度脂蛋白、三酰甘油，在光鏡下頸總動(dòng)脈顯示不規(guī)則動(dòng)脈管腔及內(nèi)膜增厚，泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)沉積在管周，細(xì)胞輕度炎性浸潤(rùn)，認(rèn)為本研究注射垂體后葉素的方法能成功復(fù)制動(dòng)脈粥樣硬化模型。另一方面判定給藥8周后麝香通心滴丸組和瑞舒伐他汀組動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的療效，結(jié)果通心滴丸組、瑞舒伐他汀組大鼠頸總動(dòng)脈脂質(zhì)沉積及內(nèi)彈力板斷裂明顯減少。

總之動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠在進(jìn)行麝香通心滴丸灌胃后hs-CRP與Lp-PL-A2降低，頸總動(dòng)脈組織光鏡下的改變，可表明麝香通心滴丸可抑制炎性反應(yīng)，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程，其療效與瑞舒伐他汀相當(dāng)。