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    調(diào)胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血功能的影響*

    2019-04-29 03:59:40趙鋒利張先進(jìn)徐運(yùn)升林新峰冼紹祥
    中國中醫(yī)急癥 2019年4期
    關(guān)鍵詞:膿毒癥黏度黏膜

    趙鋒利 趙 馥 張先進(jìn) 徐運(yùn)升 曹 蕊 林新峰 冼紹祥

    (廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州 510405)

    膿毒癥是在細(xì)菌、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)侵入機(jī)體后引起機(jī)體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),導(dǎo)致多器官功能障礙,在ICU死亡率較高達(dá)25%的一種疾病[1]。膿毒癥發(fā)生時常伴有嚴(yán)重炎癥反應(yīng)發(fā)生,后續(xù)會引起血液流變性異常與凝血功能障礙,進(jìn)而引發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血(DIC),使微循環(huán)過程發(fā)生障礙。這一異常變化會引起組織缺血缺氧,從而加劇炎癥因子對于小腸等多種組織器官的破壞,形成多器官功能障礙綜合征(MODS)[2]。有研究證明調(diào)胃承氣湯具有一定的抗菌,增強(qiáng)免疫的功能,有改善腸道血液循環(huán)的作用[3]。本實(shí)驗(yàn)研究意在應(yīng)用符合臨床表征的膿毒癥模型,觀察調(diào)胃承氣湯通過對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血功能的影響,并探討其改善腸黏膜屏障功能的機(jī)制?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量280~320 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002,實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號No.44007200047550。動物實(shí)驗(yàn)環(huán)境:廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級動物實(shí)驗(yàn)室,設(shè)施使用許可證號SYXK(粵)2010-0059。

    1.2 試藥與儀器 調(diào)胃承氣湯高劑量組為9.45 g/kg,低劑量組為4.73g/kg。大黃(130908261)、芒硝(130707541)、甘草(130713191)均購自康美藥業(yè)股份有限公司。活化部分凝血活酶時間(APTT)測定試劑盒(凝固法,生產(chǎn)批號 173211012);凝血酶原時間(PT)測定試劑盒(凝固法,生產(chǎn)批號 176209011);凝血酶時間(TT)測定試劑盒(凝固法,生產(chǎn)批號172911011)。以上試劑均購自北京普利生儀器有限公司。大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(TNF-α),生產(chǎn)批號 569180115;大鼠D-乳酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 (D-LA),生產(chǎn)批號254180115。以上試劑盒均購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司。鋨酸晶體、Epon812純樹脂與檸檬酸鉛,均購自美國TED PELLA公司;醋酸雙氧鈾,購自美國SPI公司。C2000-A高性能血凝儀(北京普利生儀器有限公司)。Hemsr全自動血流變檢測儀(LBY-N7500A,中國);L-600臺式大容量低速離心機(jī) (上海利鑫堅離心機(jī)有限公司);Varioskan Flash型全波長多功能酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;UC-7超薄切片機(jī),德國萊卡公司;JEM-1400 PLUS日本電子透射電子顯微鏡,日本JEOL公司。

    1.3 模型制備 根據(jù)臨床表現(xiàn),采用表征與之最為相似的盲腸結(jié)扎穿刺法(CLP)建立腸源性膿毒癥大鼠模型[4]。造模前大鼠禁食12 h,不禁水,用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射以麻醉大鼠。大鼠處于麻醉狀態(tài)后備皮,采用無菌手術(shù)刀沿腹中線盲腸區(qū)域開口約1~2 cm,小心取出盲腸并置于消毒紗布上,用消毒棉簽將部分糞便推至盲腸尾端。采用1號醫(yī)用真絲編織線結(jié)扎盲腸中段,注射1 mL 0.9%氯化鈉注射液稀釋糞便以便流出,用10 ml注射器針頭將盲腸穿3次孔,糞便能順利慢慢流出即可,將盲腸放回腹腔。逐層縫合后腹腔注入5 mL 37℃0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行生理復(fù)蘇大鼠。歸籠,自由飲食飲水。

    1.4 分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只。具體組別與給藥方案見表1。給藥時間為模型建立成功后2 h、10 h與24 h。

    表1 大鼠組別與給藥方案

    1.5 標(biāo)本采集與檢測 24 h給藥完成0.5 h后用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈采血,3 mL枸櫞酸抗凝血,4 mL非抗凝血,血液3 000 r/min離心10 min后取血清。取約1 mm3小腸組織塊置于預(yù)冷2.5%中性戊二醛固定液中,前固定2 h或以上。以備電鏡檢查。1)血液系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)檢測。運(yùn)用Hemsr全自動血流變檢測儀檢測各組大鼠全血黏度(低切、中切與高切)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和血漿黏度;運(yùn)用C2000-A高性能血凝儀檢測各組大鼠血清中APTT、PT和TT。嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒檢測血清中TNF-α和D-LA含量。2)腸黏膜組織超微結(jié)構(gòu)觀察。取2.5%戊二醛固定標(biāo)本,用0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗6次,每次30 min。1%鋨酸固定1.5~2 h。用0.1 mmol/L磷酸緩沖液漂洗3次,每次10 min。酒精梯度脫水,樹脂浸透,包埋,固化,切8 nm超薄片,鈾鉛雙染色,透射電鏡下觀察。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),服從正態(tài)分布以(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,方差齊時用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較 見表2,圖1。與假手術(shù)組相比,GOS模型組大鼠全血黏度(低切、中切與高切)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)與血漿黏度顯著升高 (P<0.01)。與GOS模型組相比,烏司他丁組、TWCQT高劑量與低劑量組大鼠全血黏度(低切、中切與高切)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)與血漿黏度顯著降低(P<0.01)。

    表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(x±s)

    表2 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較(x±s)

    與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與 GOS 模型組比較,△△P<0.01。 下同

    全血黏度(mPa·s)組 別 n低切 中切 高切17.7±1.00 7.91±0.59 5.66±0.43 2.61±0.25 1.18±0.02血漿黏度(mPa·s)紅細(xì)胞聚集指數(shù)假手術(shù)組 8 GOS模型組 8烏司他丁組 8 25.20±2.94**12.45±1.53** 8.10±0.82**16.62±2.72△△ 7.73±1.08△△ 6.17±0.41△△3.54±0.39**1.36±0.03**2.69±0.35△△ 1.19±0.03△△TWCQT高劑量組 8 TWCQT低劑量組 8 19.58±0.98△△ 8.15±1.03△△ 6.49±0.48△△ 2.73±0.39△△ 1.19±0.02△△18.42±1.11△△ 8.13±0.57△△ 6.62±0.59△△ 2.70±0.50△△ 1.18±0.02△△

    圖1 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)變化

    2.2 各組大鼠凝血功能的比較 見表3,圖2。與假手術(shù)組相比,GOS模型組大鼠血清中APTT、PT與TT顯著延長(P<0.01)。與GOS模型組相比,烏司他丁組、TWCQT高劑量與低劑量組大鼠血清中APTT、PT與TT 明顯縮短(P<0.01)。

    2.3 各組大鼠血清中相關(guān)指標(biāo)的比較 見表4,圖3。與假手術(shù)組相比,模型組血清中TNF-α和D-LA含量顯著升高(P<0.01)。與GOS模型組相比,烏司他丁組、TWCQT高與低劑量組血清中TNF-α和D-LA含量顯著降低(P<0.01)。

    表3 各組大鼠凝血功能比較(s,x±s)

    表3 各組大鼠凝血功能比較(s,x±s)

    組 別 n TT假手術(shù)組 8 23.80±1.26 GOS模型組 8 33.92±3.20**烏司他丁組 8 25.20±3.43△△APTT PT 27.17±2.01 15.92±0.70 44.02±2.82**23.72±1.38**28.80±1.20△△ 17.51±1.08△△TWCQT高劑量組 8 27.89±2.49△△32.84±2.26△△ 18.75±1.11△△TWCQT 低劑量組 8 32.07±2.58△△17.40±1.13△△ 25.56±1.81△△

    圖2 各組大鼠凝血功能的變化

    表4 各組血清TNF-α和D-LA含量比較(s,x±s)

    表4 各組血清TNF-α和D-LA含量比較(s,x±s)

    組 別假手術(shù)組GOS模型組烏司他丁組TWCQT高劑量組TWCQT低劑量組n 8 8 8 TNF-α(pg/mL) D-LA(nmol/mL)85.63±8.93 0.18±0.02 125.69±9.10** 0.37±0.04**93.54±9.45△△ 0.23±0.04△△8 93.72±6.09△△ 0.26±0.05△△8 90.61±10.13△△ 0.25±0.03△△

    圖3 各組大鼠血清TNF-α和D-LA含量的變化

    2.4 各組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)電鏡觀察 見圖4。假手術(shù)組大鼠微絨毛結(jié)構(gòu)完整且排列緊密,線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器無異常,緊密連接并無增寬;GOS模型組大鼠微絨毛嚴(yán)重斷裂脫落,線粒體嚴(yán)重腫脹且破裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形,緊密連接擴(kuò)張;烏司他丁組、TWCQT高劑量組與低劑量組大鼠較GOS模型組微絨毛無斷裂脫落,線粒體無嚴(yán)重腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞較少,緊密連接無明顯擴(kuò)張,整體結(jié)構(gòu)完整。

    3 討 論

    圖4 各組大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)

    膿毒癥初發(fā)期,細(xì)菌與內(nèi)毒素感染迫使機(jī)體迅速啟動抗炎系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控,大量炎癥因子釋放入血[5]。產(chǎn)生的炎癥因子直接損傷具有抗凝與抗黏附作用的血管內(nèi)皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞功能破壞后可引起出血導(dǎo)致DIC,伴隨血液流變學(xué)指標(biāo)與凝血功能異常[6]。這種血液循環(huán)系統(tǒng)的障礙會延長炎癥因子在組織中的浸潤,產(chǎn)生持久性的器官損害作用[7]。一般腸黏膜組織最先受到炎癥因子的攻擊[8],因此,血液流變學(xué)與凝血功能的障礙使得小腸黏膜組織屏障功能被炎癥因子破壞后,會引起其破壞作用的進(jìn)一步加劇形成SIRS,導(dǎo)致多種器官的障礙,加劇膿毒癥的危害。

    一旦炎癥因子激活凝血系統(tǒng),抗凝血酶與凝血因子之間平衡打破。同時,纖溶系統(tǒng)被抑制,造成纖維蛋白溶解速度遠(yuǎn)小于形成速度。二者將導(dǎo)致凝血功能的嚴(yán)重紊亂,且呈現(xiàn)出凝血系統(tǒng)激活后又促進(jìn)炎癥因子作用的正反饋調(diào)節(jié),加重炎癥反應(yīng)的進(jìn)行[9]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中,通過對凝血功能指標(biāo)APTT、PT與TT的測定,可判斷機(jī)體凝血功能的變化情況[10]。膿毒癥炎癥反應(yīng)使血液黏度增加,導(dǎo)致血液循環(huán)阻力增大,血流速度減慢,血管內(nèi)皮及其他組織細(xì)胞缺血缺氧,這種血液流變學(xué)指標(biāo)異常會引起組織器官的損傷[11]。血液流變學(xué)指標(biāo)中的紅細(xì)胞聚集指數(shù)反映紅細(xì)胞表面電荷大小,其值越大細(xì)胞越趨向于聚集,引起全血黏度增大。血漿黏度指標(biāo)的變化也可反應(yīng)凝血功能的變化,血漿黏度值越大表明其加速纖維蛋白原的“搭橋”的作用越強(qiáng),從而加速凝血過程的能力越強(qiáng)[12]。因此,檢測血液流變學(xué)與凝血功能指標(biāo)即可反映血液循環(huán)系統(tǒng)障礙變化,從而判斷其對機(jī)體炎癥反應(yīng)的影響程度。

    當(dāng)細(xì)菌、內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)引起感染時,體內(nèi)促炎因子與抗炎因子的動態(tài)平衡狀態(tài)被打破,刺激巨噬細(xì)胞等分泌大量TNF-α等促炎因子,進(jìn)而對組織器官產(chǎn)生損傷作用[13]。因此,血清中TNF-α可判斷機(jī)體炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度;D-LA是胃腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸菌、克雷白桿菌等多種固有細(xì)菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,哺乳動物正常組織無法產(chǎn)生D-LA,并且也無相應(yīng)的乳酸脫氫酶將其代謝[14]。當(dāng)腸黏膜屏障受損時,D-LA會通過受損黏膜進(jìn)入血液循環(huán),此時血中D-LA水平顯著增加。因此,檢測血中D-LA含量即可反映腸黏膜受損程度。

    本研究結(jié)果顯示,調(diào)胃承氣湯能顯著抑制腸源性膿毒癥大鼠APTT、PT與TT的延長,抑制腸源性膿毒癥大鼠全血黏度、血漿黏度與紅細(xì)胞聚集數(shù)的增加,有效地改善膿毒癥的血液流變性與凝血功能障礙。血清中TNF-α的顯著降低也反映了調(diào)胃承氣湯對血液循環(huán)系統(tǒng)的改善作用,從而抑制了炎癥反應(yīng)的加劇。腸黏膜超微結(jié)構(gòu)與D-LA含量變化則顯示調(diào)胃承氣湯減少了炎癥因子對小腸黏膜組織的破壞,起到腸黏膜屏障功能的保護(hù)作用。

    綜上,調(diào)胃承氣湯能有效地改善腸黏膜屏障功能,這種改善作用的機(jī)制可能是調(diào)胃承氣湯能通過對腸源性膿毒癥大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血功能的影響,減少炎癥因子對腸黏膜組織結(jié)構(gòu)的破壞作用。

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