瀕危植物中甸刺玫種子休眠及其生態(tài)學(xué)意義

潘麗蛟，關(guān)文靈，李懿航

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)資產(chǎn)管理處，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；3.昆明冶金高等?？茖W(xué)校后勤管理處，云南 昆明 650201)

中甸刺玫Rosa praelucens為薔薇科薔薇屬落葉灌木，是中國云南的特有種，僅分布在云南中甸高原，是典型的狹域分布種。中甸刺玫花大色艷，有香味，開花繁茂，是薔薇屬野生資源中的大花類型，具有極高的觀賞性，是十分珍貴的高山花卉資源，是高海拔地區(qū)園林綠化的樹種，也是月季雜交育種的重要親本材料，其果實富含營養(yǎng)。因此，中甸刺玫具有極高的保護和開發(fā)價值。該物種野生種群分布點有限且分散，生境脆弱，天然更新困難，亂挖亂采現(xiàn)象嚴(yán)重，分別被《中國物種紅色名錄》、《中國生物多樣性紅色名錄》列為易危物種和極危物種[1]。目前，對中甸刺玫的研究主要在種群分布特征[2]、引種馴化[3]、雜交起源[4]等方面，對其種子休眠和萌發(fā)方面的報道非常少。

瀕危植物的種子休眠特性是導(dǎo)致植株瀕危的一個重要原因[5]。海南龍血樹Dracaena cambodiana種子萌發(fā)對果皮、溫度、光照強度等微環(huán)境的依賴性較強，原有生境破壞導(dǎo)致種子萌發(fā)微環(huán)境的改變可能是其處于瀕危狀態(tài)的主要原因之一[6]。羽葉丁香Syringa pinnatifolia致瀕的內(nèi)部原因是其種子含有水溶性萌發(fā)抑制物，種群缺少實生幼苗[7]。珙桐Davidia involucrata、翅果油樹Elaeagnus mollis、裂葉沙參Adenophora lobophylla等瀕危植物的致瀕機制主要是其果實的特殊構(gòu)造或果實構(gòu)造在萌發(fā)中不占優(yōu)勢[8—13]。因此，在保護珍稀瀕危植物工作中，開展種子休眠和生態(tài)學(xué)特性研究有重要意義。

種子繁殖是被子植物最常規(guī)的繁殖方式之一。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中甸刺玫野外繁殖率低，居群內(nèi)存在根蘗苗和小幼苗，說明其繁殖大部分是通過根蘗苗的形式來完成，實生苗繁殖較少[4]。為較好地利用中甸刺玫這一珍稀瀕危植物，本文從種子結(jié)構(gòu)、種子內(nèi)抑制物活性等方面探索其休眠特性，探索中甸刺玫種子休眠的原因、類型及破解方法，從種子生物學(xué)角度了解中甸刺玫的生態(tài)適應(yīng)機制及瀕危原因，為種群的保護、恢復(fù)和可持續(xù)利用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中甸刺玫種子采自香格里拉縣小中甸鎮(zhèn)(27.499°N，99.732°E)，該地區(qū)位于滇西地區(qū)橫斷山脈和滇中地區(qū)紅色高原交接處，是印度支那半島和青藏高原的轉(zhuǎn)折區(qū)域。主要受西南季風(fēng)和南支西風(fēng)急流的交替控制，形成寒溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫 5.8 ℃，最熱月平均氣溫 11.7～24.1℃，極端最低氣溫-19.4 ℃，年日照時數(shù)1742.9～2186.6 h，年均降雨量268～945 mm，無霜期129～197 d。

2011年10月中旬采集新鮮種子后，自然晾干，人工剝離肉質(zhì)果殼，放入瓶中室溫儲藏。研究中甸刺玫種子萌發(fā)抑制物選用白菜Brassica rapavar var. pekinensis種子，純度≥95%，凈度≥97%，發(fā)芽率≥82%，含水量≤8.0%。

采集香格里拉縣與中甸刺玫同一生長海拔(3300～4300 m)的薔薇科峨眉薔薇Rosa omeienisis種子，自然晾干，人工剝離果殼，放入瓶中室溫儲藏。峨眉薔薇生長于海拔750～4500 m，分布普遍，四川、湖北、陜西、寧夏、甘肅、青海、西藏地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，屬廣布種，適應(yīng)性強，抗病抗逆性強，故選用峨眉薔薇作為參照研究中甸刺玫種子形態(tài)。

1.2 方法

1.2.1 瘦果、種子形態(tài)觀察 對10個樣地的中甸刺玫假果進行取樣，每個樣地隨機取10個假果。在采摘一周后，對其瘦果重量、瘦果直徑、果實結(jié)籽率、種子直徑、千粒重等5個指標(biāo)進行測量。用相同方法測量峨眉薔薇的果實和種子。

1.2.2 千粒重測定 參照《林木種子檢驗規(guī)程》(GB 2772-1999)相關(guān)規(guī)定，采用百粒重法測定種子千粒重，對10個樣地的種子進行取樣，每個樣地隨機取100粒種子，并分別用1/1000天平稱取100粒種子的重量，測量后取平均值后乘以10。用相同方法測量峨眉薔薇。

1.2.3 種皮掃描電鏡觀察 將不經(jīng)任何處理的干燥種子的正面、立面和剝除胚的種殼粘于樣品臺上，經(jīng)噴金鍍膜，在掃描電鏡下觀察種子的種臍、外種皮、內(nèi)種皮等。置于KYKY-EM 3200掃描電鏡觀察并拍照，工作電壓25 kV。

1.2.4 種子吸水性 將干燥種子，濃硫酸處理3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h的種子，剝離種皮的種子分別放入蒸餾水中，每天用吸水紙吸干種子表面水分后稱重，直至恒重。每處理3次重復(fù)，取平均值。吸水率(%)=(Wx- W0)/ W0×100%。

1.2.5 果實結(jié)籽率 對10個樣地的假果進行取樣，每個樣地隨機取10個假果，分別觀察種子數(shù)量，并記錄。用相同方法測量峨眉薔薇。結(jié)籽率=飽滿種子數(shù)/(空癟種子數(shù)+飽滿種子數(shù))。

1.2.6 赤霉素處理對胚的影響 采用不同濃度(100、500、1000 mg·kg-1)赤霉素處理胚，放置于20 ℃恒溫箱中，注意保持蛭石濕潤，定期觀察，以胚根伸長3 mm作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，分別記錄胚的萌發(fā)情況。

1.2.7 果殼、種皮、胚乳粗提物制備與活性測定

1.2.7.1 粗提物制備 隨機取種子 30粒，分離肉質(zhì)果皮、種皮、胚乳，然后將各部分分別用 80%甲醇研碎、浸提、過濾之后，仍用80%甲醇浸提殘渣，重復(fù)3次，合并濾液，減壓濃縮蒸干，用蒸餾水洗脫，定容至5 mL。

1.2.7.2 粗提物對白菜籽萌發(fā)的影響 用清水和不同濃度浸提液25 ℃下浸泡白菜種子2 h，然后每培養(yǎng)皿放入40粒種子，在25 ℃光照培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)培養(yǎng)，48 h后統(tǒng)計白菜籽發(fā)芽率，重復(fù)3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 用Microsoft Excel 2010軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件進行處理間多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)與結(jié)籽率

中甸刺玫瘦果呈肉質(zhì)，黃綠色，瘦果平均重量82.53 g，平均直徑3.51 cm。種子表皮多數(shù)為淺褐色或褐色，少數(shù)呈黑色的種子不具胚或胚未發(fā)育完全。種子長7.54 mm，寬5.02 mm，厚3.96 mm。種子直徑為3.51 mm。

中甸刺玫的結(jié)籽率為0.69，顯著低于峨眉薔薇的結(jié)籽率(0.96)(表1) ，多數(shù)果實中沒有飽滿的種子。結(jié)籽率較低可能是導(dǎo)致中甸刺玫瀕危的原因之一。

2.2 千粒重

中甸刺玫種子的千粒重為86.37 g(表1)。然而10個樣方的種子千粒重在67.07～122.65 g之間，樣方間差異較大，這可能與各個樣方的土壤、光照等因子的差異有關(guān)。

表1 峨眉薔薇與中甸刺玫種子物理性狀特征值Table 1 Physical value of seeds of Rosa praelucens and R. omeienisis

2.3 種皮解剖結(jié)構(gòu)

2.3.1 種子各部分所占比例 中甸刺玫種子的外種皮重量占種子重量的21.38%，內(nèi)種皮占2.11%，胚占76.42%，胚乳占0.09%。

2.3.2 種皮結(jié)構(gòu) 中甸刺玫掃描電鏡觀察顯示，外種皮光滑且堅硬，由排列緊密的多層厚壁細胞組成的排列緊密的表皮細胞(圖2: A)，再向內(nèi)為堅硬致密的纖維狀的內(nèi)種皮，屬于明顯的柵欄組織，緊緊的包裹著胚(圖2: B)。中甸刺玫的種子極面觀為圓形(圖2: C)，赤道面觀為橢圓形，外壁表面有細網(wǎng)狀紋飾，并且有不規(guī)則突起，種臍比較明顯。

圖2 中甸刺玫種皮顯微結(jié)構(gòu)Fig. 2 Seed coat microstructure of Rosa praelucens

2.4 種皮吸水性

圖3顯示，在25 ℃時，中甸刺玫未處理的種子吸水率較低，吸水量增加不明顯，13 d后增加量為18.82%。濃硫酸處理的種子吸水量迅速增加，且處理時間較長的種子吸水量快速增加。吸水24 h后去種皮處理和濃硫酸處理6 h的種子開始迅速吸水。至第3天后去種皮處理種子和濃硫酸處理6 h的種子吸水量基本保持不變，表明種子已經(jīng)飽和。由此可見，中甸刺玫的種皮透水性較差，對種子有效吸收水分的影響較大，是阻礙種子萌發(fā)的因素之一。

2.5 赤霉素處理對胚的影響

用不同濃度赤霉素處理中甸刺玫種胚，從胚的萌發(fā)率來看，各濃度處理間存在顯著差異。由表2可以看出當(dāng)赤霉素為100 mg·kg-1時，對胚培養(yǎng)的萌發(fā)起到最顯著的作用，萌發(fā)率為63.87%，說明100 mg·kg-1的赤霉素預(yù)處理可以加快胚的萌發(fā)速率。

2.6 種子萌發(fā)抑制物活性

用中甸刺玫種子各部分粗提液處理白菜種子，觀察其48 h后的萌發(fā)效果。結(jié)果表明，中甸刺玫粗提液對白菜種子萌發(fā)的抑制效果為：胚乳＞種皮＞果殼(表 3)。胚乳粗提液處理的白菜種子萌發(fā)率最低，種皮粗提液的抑制作用與果殼粗提液的抑制作用差異不顯著，但都顯著低于對照。說明中甸刺玫胚乳、種皮、果殼中存在萌發(fā)抑制物，與其種子休眠有關(guān)。

圖3 不同處理對種子吸水率的影響Fig. 3 Effect of factor on water permeation

表2 不同濃度赤霉素處理對胚的影響Table 2 Germination of embryo treated with GA3

表3 果實與種子提取液處理的白菜種子萌發(fā)率Table 3 Germination rate of Brassica rapavar var.pekinensis seeds treated with methanol extracts of Rosa praelucens fruits and seeds

3 討論

3.1 種子休眠類型

種子的休眠現(xiàn)象廣泛存在于植物當(dāng)中，Baskin等[16]將種子休眠劃分為5種類型，即生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和綜合休眠。在本研究中，種子吸水試驗顯示，通過機械損傷預(yù)處理種子，在2 d內(nèi)能明顯提高種子的吸水率，可以達到種子萌發(fā)所需的含水量，完整種子在7 d內(nèi)仍然無法達到種子萌發(fā)所需含水量。通過電鏡觀察，中甸刺玫外種皮光滑且十分堅硬，由多層排列緊密的厚壁細胞組成，內(nèi)種皮堅硬致密，纖維狀，屬于明顯的柵欄組織，緊緊地包裹著胚。物理休眠是由種皮或者果皮中一層或者多層不透水的柵欄細胞所引起的。機械或者化學(xué)損傷可以解除物理休眠[6]。因此，種皮不透水性是導(dǎo)致中甸刺玫種子萌發(fā)困難的原因之一，可能屬于物理休眠和綜合休眠。

生理休眠是最普遍的休眠類型，廣泛存在于裸子植物和大多數(shù)被子植物的種子中[6]。中甸刺玫種皮、果殼、胚乳的甲醇粗提取液均對白菜籽萌發(fā)有明顯的抑制作用，說明存在抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物，抑制了中甸刺玫種子萌發(fā)。

中甸刺玫種子具有物理休眠和生理休眠的特征，屬于綜合休眠。種皮吸水性較差，100 mg·kg-1赤霉素預(yù)處理可以明顯提高胚的萌發(fā)率。

3.2 種子休眠的生態(tài)學(xué)意義

種子休眠是其對自然生態(tài)環(huán)境適應(yīng)的一種方式[14]，對植物的生存、繁殖有著重要的意義[15—16]。中甸刺玫在適應(yīng)性進化過程中形成的種子休眠與萌發(fā)有以下三點意義：其一，中甸刺玫僅生長于云南省香格里拉縣小中甸盆地碩多崗河流域內(nèi)，生長地幾乎為平緩的盆地及鄰近山麓，果實于9～10月成熟，此時為深秋，土壤水分少，對中甸刺玫的幼苗生長極為不利，種子以休眠的方式度過即將到來的寒冷冬季[4]。為適應(yīng)該環(huán)境，中甸刺玫種子在翌年春夏季溫度上升且雨水充沛時解除休眠萌發(fā)，為種群補充后代。其二，中甸刺玫果實成熟時已至深秋，為旱季，種子難以完成后熟過程；另外，中甸刺玫果實為豬喜食[4]，為適應(yīng)該情況，肉質(zhì)果表面有刺，種子形成堅硬致密的內(nèi)外種皮保護胚和胚乳，其外種皮過于堅硬導(dǎo)致胚難以充分吸水，這可能是中甸刺玫致瀕的重要原因。其三，中甸刺玫生長于高海拔環(huán)境，昆蟲多樣性和活動能力降低，有性繁殖的幾率降低，而且種子萌發(fā)困難[5]，為適應(yīng)該環(huán)境，中甸刺玫主要是通過根孽苗方式進行營養(yǎng)繁殖。

近年來，在中甸刺玫分布的小中甸區(qū)域，人口迅速增加，道路、房屋修建以及水電站等建設(shè)對其生境和種群造成了嚴(yán)重的影響。中甸刺玫雖然進化出一系列適應(yīng)惡劣生境的對策，但由于分布狹窄、數(shù)量稀少，導(dǎo)致種群數(shù)量越來越少。種子萌發(fā)困難，種群缺乏實生苗，可能降低基因交流、物種進化的幾率，增加物種淘汰的可能性。