高效液相色譜測定棉酚方法的建立及不同棉酚脫毒方法比較

亓秀曄， 謝全喜， 劉乃芝， 于佳民，趙 倩， 張志焱， 徐海燕， 谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑省級重點實驗室，山東泰安271000）

棉籽餅（粕）作為一種高蛋白含量的植物蛋白原料，營養(yǎng)價值遠比谷類蛋白質(zhì)高，近似豆類蛋白質(zhì)，是一種極具開發(fā)潛力的植物蛋白質(zhì)飼料資源。然而，棉籽粕中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等有毒物質(zhì)，制約了其在畜牧業(yè)中的應用，其中最主要的是棉酚。棉酚主要分為游離棉酚和結合棉酚，結合棉酚是指能與氨基酸、磷脂和小肽等化合物結合的棉酚，化學鍵不易被打破，在機體消化系統(tǒng)中不被吸收，可很快隨糞便排出體外，毒性很低；游離棉酚分子結構中的活性基團（醛基和羥基）對動物毒性很大，長期飼喂動物過多的未經(jīng)脫毒的棉籽粕飼料，棉酚會在動物體內(nèi)蓄積，引發(fā)中毒，損害雄性動物生殖系統(tǒng)發(fā)育，嚴重可導致動物出現(xiàn)急性呼吸窘迫臨床癥狀，厭食乏力，甚至死亡等（亓秀曄等，2018；劉建成等，2012；朱德偉等，2010）。

目前，檢測游離棉酚的方法有分光光度計法（侯敏等，2016；朱德偉等，2010）、薄層層析法（沈靜等，2011；袁久榮等，2000）、高效液相色譜（HPLC）法（阮棟等，2014；何曉文等，2013；沈媛等，2012）等。分光光度法選擇性不強，與游離棉酚有相似化學結構的物質(zhì)均能被同時檢出，使得檢測結果偏高，并且操作繁瑣，使用的苯胺等溶劑具有毒性；薄層層析法也具有樣品分離度低、準確度低、溶劑毒性較強、操作繁瑣等不足；HPLC法則具有分離效率高、靈敏度高、準確性高、簡便快速、可自動化檢測等優(yōu)點，具有廣泛的應用前景。

不同的脫毒方法對棉籽粕的脫毒效果不同，目前常用的脫毒方法分為物理法、化學法、微生物法等，每種方法都各有優(yōu)缺點。本研究旨在建立快速、準確的測定棉籽粕游離棉酚的 HPLC方法，并采用不同的脫毒方式對棉籽粕中的游離棉酚進行降解，以篩選合適的脫毒法以達到更好的脫毒效果，為棉籽粕的合理開發(fā)和利用提供理論基礎和試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵原材料及菌株 試驗用棉籽粕由山東磁窯農(nóng)場提供，粉碎過40目篩。

酵母菌（Yeast）菌株：產(chǎn)朊假絲酵母BLCC4-0327由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院菌種保藏中心保存。本項目組前期試驗已證實該株菌具有降解棉酚效果。

1.1.2 培養(yǎng)基 酵母浸出粉胨葡萄糖 （YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學試劑 葡萄糖，山東祥瑞藥業(yè)有限公司；磷酸、氯化鈉，天津博迪化工股份有限公司；磷酸二氫鉀，天津市致遠化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。乙腈、丙酮、甲醇（均為色譜級），天津市永大化學試劑有限公司；微孔濾膜 （直徑13 mm、孔徑 0.22 μm），上海安譜有限公司；棉酚標準品[高效液相色譜（HPLC級）]，上海源葉生物科技有限公司。蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母膏，天津市英博生化試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉籽粕原料 不經(jīng)過任何處理。

1.2.2 高壓高溫脫毒 將棉籽粕經(jīng)過121℃高壓滅菌1 h后，常溫冷卻。

1.2.3 硫酸亞鐵法 準確稱取500 g棉籽粕，按棉籽粕游離棉酚含量 5倍添加硫酸亞鐵（棉籽粕游離棉酚含量為1300 mg/kg），將硫酸亞鐵溶解于2500 mL水中，攪拌均勻，將500 g棉籽粕浸泡于溶液中，3 h后撈出瀝干，放置于40℃烘箱烘4 h（敖維平等，2015）。

1.2.4 尿素脫毒處理方法 稱取6.5 g尿素溶解于 400 mL水中，混勻后，噴灑在 1 kg棉籽粕粉上拌勻，壓實后密封放置7 d（斯熱吉古麗·阿山，2016）。

1.2.5 微生物發(fā)酵脫毒 酵母菌種子液的制備：將4℃條件下保存的酵母菌BLCC4-0327斜面活化，轉接到裝有50 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用。

稱取一定量的棉籽粕于1000 mL三角瓶中，料水比為 1.0∶0.4（g:mL)，裝料量為 100 g/瓶，按 2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液中，每個樣品設3個平行，以不接種任何菌株的空白料為空白對照，均置于30℃培養(yǎng)箱進行需氧發(fā)酵48 h。

1.3 游離棉酚含量的測定 棉酚標準溶液的配制：準確稱取棉酚標準品，用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶解得1.17 mg/mL的標準品貯備液，標準貯備液再用乙腈 -0.2%磷酸（體積比為85∶15）稀釋成117 μg/mL的標準品工作液 （陳來等，2012）。用流動相將標準品工作液逐級稀釋得到濃度分別為 78.48、39.24、13.08、5.232、1.308 μg/mL的標準工作液，濃度由低至高進行測定，以峰面積和濃度作圖，得到標準曲線回歸方程，為：Y=（5.57655e-006）X+（0.325615），R2=0.99999， 線性范圍為 1.308~117 μg/mL。

待測樣品游離棉酚的提取：準確稱取待測樣品 3.00 g，加入丙酮 30 mL，超聲提取 30 min，25 ℃下3000 r/min離心10 min，重復提取3次，合并上清液。全部轉移至蒸發(fā)瓶中，旋轉蒸發(fā)至干，用乙腈-0.2%磷酸（體積比為85∶15）溶液溶解，多次超聲清洗轉移至25 mL容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜后供高效液相色譜（HPLC）測定。棉酚含量計算公式如下：

棉酚含量/（μg/g）=c×25 mL/m；

式中：c為棉酚溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；m為樣品質(zhì)量，g。

高效液相色譜（HPLC）法測定棉酚含量：色譜條件為色譜柱Intertsil RODS-2（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.2%磷酸（體積比為85:15）溶液，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長 235 nm，進樣量 20 μL，柱溫25℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007進行初步處理后，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）程序進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 棉酚標準曲線的繪制 由棉酚標準品的HPLC色譜圖（圖1~圖5）可以看出，在9.432 min左右出棉酚色譜峰，且穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高。由棉籽粕原樣的棉酚色譜圖（圖6）可知，棉籽粕原樣的游離棉酚含量為1300.31 μg/g。由圖7可以看出，棉酚標準曲線線性吻合良好、定量范圍廣、定量限低、準確度和靈敏度高，該方法可用于準確測定游離棉酚的含量。

圖1 棉酚標準品（1.308 μg/mL）的HPLC色譜圖

圖2棉酚標準品（5.232 μg/mL）的 HPLC 色譜圖

圖3 棉酚標準品（13.08 μg/mL）的HPLC色譜圖

圖4棉酚標準品（39.24 μg/mL）的 HPLC 色譜圖

圖5棉酚標準品（78.48 μg/mL）的 HPLC 色譜圖

圖6棉籽粕原料的HPLC色譜圖

圖7游離棉酚的標準曲線

2.2 棉酚脫毒效果比較 由表1可知，不同脫毒處理方法效果不同，棉酚脫毒率大小排序為：微生物法>硫酸亞鐵法>尿素法>高溫高壓法。最優(yōu)的方法為微生物法，酵母菌發(fā)酵48 h后的發(fā)酵棉籽粕棉酚降解率高達93.86%；化學法（硫酸亞鐵法和尿素法）脫毒率為53.64%~78.18%，物理法（高溫高壓）脫毒率最低，為41.00%。

表1 不同脫毒方法比較

3 討論

3.1 物理法對棉籽粕脫毒效果 物理法主要包括熱處理法、溶劑浸提法、擠壓膨化法等（李賢永等，2008）。熱處理法是對棉籽粕進行加熱處理，使棉籽粕中的游離棉酚與蛋白質(zhì)相絡合，由此達到脫去棉籽粕中游離棉酚的目的。本試驗中，121℃高壓滅菌1 h棉酚脫毒率僅有41.00%，可能與處理時間短有關。熱處理方法所處理過的棉籽粕中的蛋白質(zhì)容易發(fā)生美拉德反應，賴氨酸和游離棉酚結合，導致蛋白質(zhì)利用率降低，同時加熱將會耗費大量能源，成本過高。

3.2 化學法對棉籽粕脫毒效果 化學脫毒法是指在棉籽粕中加入某種化學添加劑進行化學處理，在一定條件下破壞游離，或使其成為結合棉酚而失去毒性，達到脫毒的目的。有毒性的游離棉酚具有3種互變異構體，通常情況下呈相對穩(wěn)定的雙醛式。FeSO4中的 Fe2+能與雙醛式游離棉酚反應生成變性棉酚-鐵絡合物，使游離棉酚的活性羥基失去作用而達到脫毒的目的。此棉酚-鐵絡合物不能被吸收，最終排出體外，不會對動物體產(chǎn)生不良的負作用。因此FeSO4既可以作為棉酚的解毒劑，也能夠使棉酚在肝臟中的蓄積量下降，從而預防動物棉酚中毒（王薇薇等，2016）。本試驗采用硫酸亞鐵對棉籽粕的脫毒率為78.17%，試驗結果與李延云等 （1999）的研究結果 （脫毒率60%～85%）相一致。雖然硫酸亞鐵脫毒法科學實用，但也存在著鐵離子能與棉籽粕中有效的賴氨酸等物質(zhì)結合，而降低其營養(yǎng)價值的問題，適口性也受到影響，而且硫酸亞鐵脫毒后棉籽粕顏色發(fā)黑并帶有較濃的鐵銹味，因此，不宜作為脫毒劑對棉籽粕脫毒。

尿素是主要的酞氨化合物之一，在一定濕度、溫度下棉籽粕中游離棉酚能與酞氨類化合物生成西佛堿類加成物，經(jīng)脫水后生成西佛堿，使游離態(tài)棉酚轉變?yōu)闊o毒的結合態(tài)棉酚，達到脫毒目的。采用該法處理棉籽粕不僅可以達到脫除棉酚的目的，而且能改善適口性，彌補了硫酸亞鐵處理后適口性不好的問題 （石秀俠等，2005；張?zhí)K紅等，2005）。但是本試驗采用尿素處理棉籽粕后，棉酚脫毒率較低，只有53.64%，試驗結果與王倩等（2015）的報道一致。此外，尿素處理成本比較高。3.3 微生物脫毒 微生物發(fā)酵法是目前普遍認為成本低、效果好、較安全的脫毒方法（Dai等，2015； Sun 等，2012；Yang等，2012）。 生物發(fā)酵的脫毒主要途徑是微生物可分泌降解棉酚類物質(zhì)的酶類，分解、利用游離棉酚，從而降低游離棉酚的含量；發(fā)酵時，一些游離棉酚可與微生物分泌的氨基酸，或與活性蛋白質(zhì)中游離氨基結合而形成無毒的結合棉酚；固體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理，在高溫、高壓過程中，一部分游離棉酚的結構會被破壞掉，也會使部分游離棉酚和蛋白質(zhì)中游離氨基結合，形成無毒的結合棉酚（張煜等，2018）。

酵母菌的脫毒作用主要表現(xiàn)在兩個方面：酵母菌對真菌毒素、細菌內(nèi)毒素及其他有害有毒物質(zhì)具有減毒或脫毒作用；酵母菌細胞壁中的β-葡聚糖及糖蛋白可參與生物脫毒過程 （胡曉清等，2017）。本試驗中，酵母菌發(fā)酵棉籽粕后降解棉酚效果最好，達到93.86%。

4 結論

4.1 本試驗建立的HPLC法測定棉籽粕中棉酚含量，棉酚色譜峰出峰穩(wěn)定性良好、分離效果好、峰型理想、靈敏度高，可以高效的檢測棉酚含量。

4.2 不同處理方法對棉籽粕脫毒效果不同，棉酚脫毒率大小排序為：微生物法>硫酸亞鐵法>尿素法>高溫高壓法。最優(yōu)的方法為微生物法，酵母菌發(fā)酵48 h后的發(fā)酵棉籽粕棉酚降解率高達93.86%；化學法（硫酸亞鐵法和尿素法）脫毒率為53.64%~78.18%，物理法（高溫高壓）脫毒率最低，為41.00%。