長鏈非編碼RNA HOTAIR靶向miR-1對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響

董孟寧， 張建黨，張元峰，韓偉一

(南陽市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 南陽473009)

膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，具有較高的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移率和致死率。據(jù)報道，經(jīng)常規(guī)治療的膠質(zhì)瘤患者生存時間中位數(shù)僅有15個月[1]。因此探究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找治療膠質(zhì)瘤的新方法顯得尤為迫切。長鏈非編碼RNA是一類在哺乳動物體內(nèi)高度保守的RNA，不參與蛋白質(zhì)的編碼，但能通過調(diào)控基因的表達(dá)過程影響疾病的發(fā)生發(fā)展，如影響基因轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾及調(diào)控表觀遺傳等[2]。研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs在多類疾病中均出現(xiàn)表達(dá)異常，特別是癌癥[3,4]。大量研究表明，LncRNAs在膠質(zhì)瘤中表達(dá)也有不同程度的升高和降低，如LncRNA CCAT1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，能通過靶向抑制微小型RNA-410(microRNA-410,miR-410) 的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[5]。LncRNA GRNDE在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)增多，能通過調(diào)控mTOR信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和侵襲[6]。也有研究表明，LncRNA HOTAIR在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，與膠質(zhì)瘤患者的存活時間及預(yù)后密切相關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記物[7,8]。HOTAIR可通過靶向調(diào)控miR-326的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[1]。miR-1是一類抑癌基因，在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)水平，Su DN等人研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能通過負(fù)向調(diào)控miR-1的表達(dá)促進(jìn)肝癌的發(fā)展[9]，但HOTAIR是否能通過靶向調(diào)控miR-1的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存及侵襲轉(zhuǎn)移能力還未見報道。本文通過沉默HOTAIR的表達(dá)，探究HOTAIR對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存、侵襲及遷移的影響及機(jī)制，為HOTAIR應(yīng)用于臨床膠質(zhì)瘤的預(yù)防及治療提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、U118和LN18購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American type culture collection,ATCC)。RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司，青霉素和鏈霉素購自美國BI公司。Trizol試劑、RIPA裂解液和BCA試劑盒購自北京索萊寶生物公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶報告檢測試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自美國ThermoFisher公司。shRNA HOTAIR (sh-HOTAIR) 和miR-1 inhibitor購自上海吉滿生物科技公司，實驗所用引物采用Primer 3網(wǎng)站設(shè)計，由上海生工合成。Ki67、Bcl-2、Bax、基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (Matrix metalloproteinase-2,MMP-2) 和MMP-9購自美國Santa Cruz公司，實驗所有二抗購自上海博士德生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清，100 μg/mL的鏈霉素和100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、U251、U118和LN18，培養(yǎng)環(huán)境條件為37 ℃、5% CO2，隔天進(jìn)行換液，細(xì)胞融合率達(dá)到85%以上時進(jìn)行傳代，傳代濃度為1×104個/mL。

1.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞分為Control組、sh-HOTAIR組、miR-1 inhibitor組和sh-HOTAIR + inhibitor組，將細(xì)胞接種于6孔板中，種板濃度為1×105個/mL。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用sh-HOTAIR轉(zhuǎn)染sh-HOTAIR組細(xì)胞，miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor組細(xì)胞，用sh-HOTAIR和miR-1 inhibitor同時轉(zhuǎn)染sh-HOTAIR + inhibitor組細(xì)胞，Control組則加入等量載體進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)染6 h后更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 RT-PCR檢測HOTAIR和miR-1的表達(dá)

用Trizol試劑提取膠質(zhì)細(xì)胞株U87、U251、U118和LN18及用sh-HOTAIR處理后的U251細(xì)胞的總RNA進(jìn)行定量分析后，每組取等量的RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增后，采用實時定量PCR試劑盒對其進(jìn)行定量分析。

1.5 熒光素酶報告實驗

通過生物信息預(yù)測HOTAIR和miR-1的結(jié)合片段，采用PCR進(jìn)行擴(kuò)增并插入到熒光素酶報告酶載體中，構(gòu)建HOTAIR 野生型 (wt) 質(zhì)粒；采用基因突變技術(shù)對HOTAIR序列上與miR-1的結(jié)合位點的個別核苷酸進(jìn)行突變 ，構(gòu)建HOTAIR突變型 (mut) 質(zhì)粒。用miR-1 mimic和HOTAIR wt或HOTAIR mut共同轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，24 h后檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.6 CCK8檢測細(xì)胞活性

按照1.3所描述的方法轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)0 d、1 d、2 d、3 d和4 d根據(jù)CCK8試劑盒說明書每孔分別加入10 μl的CCK8溶液，37 ℃孵育3 h后于450 nm處檢測各組細(xì)胞吸光度，計算細(xì)胞的增殖生長倍數(shù)。

1.7 流式檢測細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞按照1.3所描述的方法進(jìn)行處理后，用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的冷酸鹽緩沖液清洗3次后，用結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106個/mL，取100 μl細(xì)胞懸液加入到試管中，并加入5 μl的Annexin V和10 μl的PI溶液，室溫避光孵育15 min后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力

實驗前將Matrigel放于4 ℃融化，融化后取少量Matrigel加入到Transwell小室中進(jìn)行預(yù)包被，并盡量避免氣泡產(chǎn)生。將細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，按照1.3的方法進(jìn)行分組后轉(zhuǎn)染，用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后用棉簽擦去上層未遷移的細(xì)胞，用HE染色液將下層遷移細(xì)胞染色并進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計。

1.9 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

實驗前用記號筆于12孔板背面劃線，使至少有5條線穿過每個培養(yǎng)孔。將細(xì)胞接種于12孔板中，并進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后用10 μl的槍頭垂直于背面直線劃痕，用磷酸鹽緩沖液洗去被刮下的細(xì)胞，換用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。記錄0 h和24 h的劃痕寬度，計算劃痕閉合率[劃痕閉合率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]。

1.10 免疫印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

將細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，用裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒進(jìn)行定量分析后，調(diào)平各組細(xì)胞蛋白濃度。每組分別取30 μg蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE分離各組蛋白，用半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜并加入5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，之后加入適應(yīng)濃度一抗于4 ℃孵育過夜，第二天洗去未結(jié)合一抗，加入二抗于37 ℃孵育1 h后，滴加化學(xué)發(fā)光顯色液進(jìn)行曝光顯色。以GAPDH為內(nèi)參。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

本文所有實驗數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行分析。先對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性分析，符合條件者采用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件則采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 sh-HOTAIR促進(jìn)miR-1表達(dá)

如圖1所示，HOTAIR在多類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平以U251細(xì)胞最高，因此選擇U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。用sh-HOTAIR轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，sh-HOTAIR能顯著降低U251細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)水平 (P<0.001，圖2)，并顯著升高miR-1的表達(dá)水平 (P<0.001，圖2)，表明HOTAIR能抑制miR-1的表達(dá)。

圖1 HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)

圖2 sh-HOTAIR對U251細(xì)胞HOTAIR和miR-1

2.2 HOTAIR與miR-1的靶向關(guān)系

生物信息預(yù)測結(jié)果表明，miR-1序列上存在HOTAIR的結(jié)合位點。同時，miR-1 mimic能顯著升高U251細(xì)胞miR-1的表達(dá)水平 (P<0.001，圖3)，并且還能降低HOTAIR野生質(zhì)粒的熒光素酶活性 (P<0.001，圖3)，將結(jié)合位點核苷酸進(jìn)行突變后，miR-1 mimic對HOTAIR質(zhì)粒熒光素酶活性的抑制作用消失，提示HOTAIR能靶向結(jié)合miR-1。

圖3 HOTAIR與miR-1的靶向關(guān)系

2.3 sh-HOTAIR抑制U251細(xì)胞增殖

與Control組比較，sh-HOTAIR組細(xì)胞生長倍數(shù)明顯降低 (P<0.001，圖4)，miR-1 inhibitor組細(xì)胞生長倍數(shù)明顯升高 (P<0.01，圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細(xì)胞生長速度明顯升高(P<0.001，圖4)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，sh-HOTAIR組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)水平與Control組比較明顯降低 (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor組Ki67表達(dá)水平明顯高于Control組 (P<0.001，圖8)；sh-HOTAIR + inhibitor組Ki67表達(dá)水平與sh-HOTAIR組比較明顯升高 (P<0.01，圖8)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明sh-HOTAIR能通過誘導(dǎo)miR-1表達(dá)抑制U251細(xì)胞增殖。

圖4 sh-HOTAIR對U251細(xì)胞增殖的影響

2.4 sh-HOTAIR誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡

如圖5所示，與Control組比較，sh-HOTAIR組細(xì)胞凋亡率明顯升高 (P<0.001，圖5)，miR-1 inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯降低 (P<0.01，圖5)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細(xì)胞凋亡率明顯升高 (P<0.001，圖5)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；此外，sh-HOTAIR能顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá) (P<0.001，圖8)，誘導(dǎo)促凋亡因子Bax表達(dá) (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor能顯著升高Bcl-2的表達(dá)水平 (P<0.01，圖8)，降低Bax的表達(dá)水平(P<0.01，圖8)；miR-1 inhibitor還能顯著減弱sh-HOTAIR對Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)控作用 (P<0.01，圖8)，表明sh-HOTAIR能通過促進(jìn)miR-1表達(dá)誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。

2.5 sh-HOTAIR抑制U251細(xì)胞侵襲

與Control組比較，sh-HOTAIR組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.001，圖6)，miR-1 inhibitor組侵襲細(xì)胞明顯增多(P<0.01，圖6)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組侵襲細(xì)胞明顯增多 (P<0.01，圖6)，表明sh-HOTAIR能通過誘導(dǎo)miR-1表達(dá)降低U251細(xì)胞侵襲能力。

2.6 sh-HOTAIR抑制U251細(xì)胞遷移

與Control組比較，sh-HOTAIR組細(xì)胞劃痕閉合率明顯降低 (P<0.001，圖7)；與sh-HOTAIR組比較，sh-HOTAIR + inhibitor組細(xì)胞劃痕閉合率顯著升高(P<0.01，圖7)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，sh-HOTAIR能顯著抑制U251細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá) (P<0.001，圖8)，miR-1 inhibitor能顯著促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá) (P<0.01，圖8)，miR-1 inhibitor還能顯著減弱sh-HOTAIR對MMP-2和MMP-9表達(dá)的促進(jìn)作用 (P<0.01，圖8)，提示sh-HOTAIR能通過抑制miR-1的表達(dá)抑制U251細(xì)胞遷移。

圖5 sh-HOTAIR對U251細(xì)胞凋亡的影響

圖6 sh-HOTAIR對U251細(xì)胞侵襲的影響

圖7 sh-HOTAIR對U251細(xì)胞遷移的影響

圖8 sh-HOTAIR對Ki67、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

目前大量研究表明，LncRNA的異常表達(dá)不僅能影響真核細(xì)胞基因的表達(dá)，同時還能促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展，能通過調(diào)控細(xì)胞增殖使細(xì)胞獲得無限增殖的能力，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，同時還能促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌癥惡化[10,11]。HOTAIR是一類致癌基因，于2010年首次被報道其與乳腺癌患者癌癥的轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。隨后大量研究報道表明HOTAIR在其他各類癌癥中均表現(xiàn)為高表達(dá)狀態(tài)，并且與癌癥的發(fā)生有著密切關(guān)系[13,14]。也有大量研究表明，HOTAIR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞及患者的腫瘤組織中表達(dá)均明顯增多，并與膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移有關(guān)[15]。但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。本研究首先檢測了HOTAIR在幾類膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)情況并發(fā)現(xiàn)，HOTAIR在U251細(xì)胞中表達(dá)水平最高，因此選擇U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

miR-1是一類在多種癌癥中低表達(dá)的miRNA，在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到負(fù)向調(diào)控的作用[16]。上調(diào)miR-1的表達(dá)能通過調(diào)控表皮生長因子受體抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，從而減緩膠質(zhì)瘤患者病情的惡化[17]。本文研究結(jié)果表明下調(diào)HOTAIR的表達(dá)能顯著升高miR-1在U251細(xì)胞中的表達(dá)水平，提示HOTAIR可能抑制miR-1的表達(dá)。生物信息預(yù)測結(jié)果表明，miR-1基因序列上存在連續(xù)的HOTAIR的結(jié)合位點。此外，熒光素酶報告實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1 mimic能顯著減弱HOTAIR熒光素酶的活性，將HOTAIR序列上的個別結(jié)合位點突變后miR-1 mimic抑制熒光素酶活性的抑制作用消失，進(jìn)一步證明HOTAIR能靶向抑制miR-1的表達(dá)。

細(xì)胞無限增殖是癌癥的主要特征之一，抑制癌細(xì)胞增殖也是目前臨床放化療治療癌癥的主要作用機(jī)制。研究表明，抑制HOTAIR的表達(dá)能抑制多種癌細(xì)胞的增殖，作用機(jī)制與調(diào)控miRNAs的表達(dá)有關(guān)。LIU SH等人在對胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能通過靶向抑制miR-331-3p的表達(dá)促進(jìn)人類表皮生長因子受體2表達(dá)促進(jìn)胃癌腫瘤的生長[18]。HOTAIR還能通過靶向抑制miR-1的表達(dá)調(diào)控食道鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞周期，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[19]。Di W等人研究表明，HOTAIR能通過調(diào)控miR-1-CCND信號軸促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的生長、抑制癌細(xì)胞凋亡[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，用sh-HOTAIR沉默HOTAIR的表達(dá)后，U251細(xì)胞的增殖速度和增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)水平明顯降低，細(xì)胞凋亡水平明顯升高；用miR-1 inhibitor進(jìn)一步抑制miR-1表達(dá)后細(xì)胞增殖速度明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低，并且還能顯著減弱sh-HOTAIR對細(xì)胞增殖及Ki67表達(dá)的調(diào)控作用。此外，sh-HOTAIR還能抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，能通過抑制Bax表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞存活[21]。結(jié)合實驗結(jié)果表明sh-HOTAIR能通過上調(diào)miR-1的表達(dá)抑制U251細(xì)胞存活，提示HOTAIR能通過靶向抑制miR-1表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長。

癌細(xì)胞的侵襲和遷移是癌癥轉(zhuǎn)移的主要過程，血管周圍侵襲性生長也是膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的主要方式，因此抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵[22]。研究表明，HOTAIR在癌癥中的高表達(dá)與癌癥的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制HOTAIR表達(dá)有利于減緩癌癥的發(fā)展[23]。研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR能促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲和遷移[24]，還能通過靶向下調(diào)miR-1在肝癌中的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移[9]。本文實驗結(jié)果表明，沉默HOTAIR的表達(dá)能抑制U251細(xì)胞侵襲和遷移，miR-1 inhibitor能顯著減弱sh-HOTAIR對U251細(xì)胞侵襲和遷移的抑制作用，表明sh-HOTAIR抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲和遷移的作用與調(diào)控miR-1的表達(dá)有關(guān)。此外，sh-HOTAIR還能顯著抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制miR-1表達(dá)能減弱sh-HOTAIR對MMP-2和MMP-9的調(diào)控作用。MMP-2和MMP-9是細(xì)胞侵襲和遷移的關(guān)鍵蛋白，能通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解增加癌細(xì)胞的運(yùn)動能力，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[25]。進(jìn)一步表明HOTAIR能通過靶向抑制miR-1的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲和遷移。

綜上所述，sh-HOTAIR能抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及Ki67表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)并降低Bcl-2的表達(dá)水平，miR-1inhibitor能顯著降低sh-HOTAIR對細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用；同時，sh-HOTAIR還能減少U251細(xì)胞侵襲，抑制細(xì)胞遷移及MMP-2和MMP-9表達(dá)，miR-1inhibitor能顯著減弱sh-HOTAIR對膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移的調(diào)控作用。提示HOTAIR能通過靶向miR-1促進(jìn)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，為HOTAIR應(yīng)用于臨床膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供了理論依據(jù)。