基于TNF-α/MAPK/apoB-48通路研究首烏降脂湯對(duì)高脂血癥金黃地鼠血脂的影響

婁 彬，王云杉,2，谷明林，王大為*

(1江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210028；2中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥制劑系&天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

心血管疾病已經(jīng)成為我國(guó)成年人死亡的主要原因[1]。高脂血癥是誘導(dǎo)心血管疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[2]。其中，甘油三酯(TG)是血脂的重要組成部分，也是導(dǎo)致血脂紊亂的一個(gè)重要影響因素[3]。大規(guī)模人群的流行病學(xué)和長(zhǎng)達(dá)30年的前瞻性臨床研究發(fā)現(xiàn)血中富含甘油三酯的脂蛋白(TRL)過(guò)高是導(dǎo)致心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4-5]。

小腸合成的乳糜微粒(CM)是TRL的主要組成成分，當(dāng)食物中脂質(zhì)進(jìn)入小腸黏膜上皮細(xì)胞后，與分泌的載脂蛋白B48(apoB-48)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合，就形成了CM[6]。CM進(jìn)一步加工成熟后分泌至淋巴液，循環(huán)入血，增加血液中循環(huán)TRL的含量。當(dāng)apoB-48分泌異常時(shí)，可通過(guò)增加血液中CM和TRL的含量，誘導(dǎo)血脂紊亂[7]。因此調(diào)控apoB-48的表達(dá)對(duì)治療高脂血癥具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，抑制apoB-48分泌能夠降低CM形成，減少餐后TRL含量，改善血脂紊亂[8]。Federico等[9]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子(TNF-α)可通過(guò)激活p38、ERK通路，誘導(dǎo)SREBP-1c在腸道細(xì)胞中的活化，增加apoB-48的分泌，而抑制p38的激活，可顯著降低apoB-48的分泌和CM的含量。臨床上目前還缺少通過(guò)調(diào)控apoB-48從而治療高脂血癥的降脂藥物。

首烏降脂湯的組方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，作為醫(yī)院制劑投入臨床使用，并對(duì)高脂血癥具有較好的治療效果[10]，課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示首烏降脂湯可顯著降低腸細(xì)胞TNF-α mRNA的表達(dá)水平，并對(duì)apoB-48表達(dá)有顯著的抑制作用。然而首烏降脂湯是否通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α的分泌，而減少apoB-48的分泌，改善高脂飲食誘導(dǎo)高脂血癥的效果和機(jī)制還不明確。

因此，本實(shí)驗(yàn)使用高脂飲食誘導(dǎo)的金黃地鼠高脂血癥模型，通過(guò)檢測(cè)血脂指標(biāo)評(píng)價(jià)首烏降脂湯的降脂藥效；通過(guò)檢測(cè)TNF-α的含量和絲裂原活化激酶(MAPK)通路相關(guān)通路蛋白、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)蛋白SREBP及apoB-48的表達(dá)變化，探討首烏降脂湯的降脂機(jī)制，為首烏降脂湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

非諾貝特片(法國(guó)利博福尼制藥公司，商品名力平之)；金黃地鼠apoB-48 ELISA檢測(cè)試劑盒、金黃地鼠TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒、金黃地鼠游離脂肪酸(FFA)檢測(cè)試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)；甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒、總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)測(cè)定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；p-ERK、p-p38、p-JNK和TNF-α抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；GAPDH抗體(英國(guó)Abcam公司)。

1.2 儀 器

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)；超速控溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；電子天平(美國(guó) Mettler Tolerdo公司)。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)敘利亞金黃地鼠，雌性，100～120 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。喂養(yǎng)于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：動(dòng)物處于溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%環(huán)境中，12 h光照和12 h黑暗交替，自由進(jìn)食和飲水。

1.4 動(dòng)物飼料

TP24200高脂飼料(含有10%脂肪、0.8%膽固醇、3%蛋黃和86.8%基礎(chǔ)飼料)和LAD1002標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)動(dòng)物。飼料均購(gòu)買(mǎi)于南通特羅菲飼料科技有限公司。

1.5 藥物的配制

以首烏降脂湯配方為基礎(chǔ)，取制首烏20 g，淫羊藿20 g，生山楂16 g，牛膝16 g。地黃20 g，藥物加入10倍水浸泡30 min后，煎煮45 min，濾出水提液后再加入10倍水煎煮45 min。合并提取液，濃縮至相對(duì)密度1.2～1.3(50～60 ℃)，4 ℃保存。以人給藥劑量按體表面積折算后給予金黃地鼠的劑量為3.33 g/kg，折算所得浸膏給藥量為2.91 g/kg。非諾貝特按體表面積折算后給與金黃地鼠的劑量為10 mg/kg。藥物用生理鹽水配制成混懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方 法

2.1 動(dòng)物模型建立、分組與給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，金黃地鼠按體重隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組、高脂模型組、非諾貝特治療組[10 mg/(kg·d)]和首烏降脂湯治療組[2.91 g/(kg·d)]，每組5只。空白對(duì)照組給予普通飼料，高脂模型組和治療組均給予高脂飼料。高脂喂養(yǎng)4周后連續(xù)經(jīng)口給藥治療4周，空白組和高脂模型組給予同體積生理鹽水，給藥期間高脂模型組和治療組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 攝食量、體重記錄 每天記錄每只金黃地鼠的攝食量，每周記錄動(dòng)物體重。

2.2.2 生物樣品取材以及生化指標(biāo)測(cè)定

造模4周后，禁食12 h，水自由獲取。給藥結(jié)束后，禁食12 h，不禁水，腹主動(dòng)脈取血，血清獲取和處理方法如婁東曉等[11]所述，即3 000 r/min離心15 min，獲得血清。快速剝離小腸組織，并采用生理鹽水清洗，置于-80 ℃保存。按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT等指標(biāo)的含量。

2.2.3 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)指標(biāo) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)載血清中脂蛋白B-48(apoB-48)、游離脂肪酸(FFA)、TNF-α含量。

2.2.4 小腸組織取材以及Western blot測(cè)定 稱(chēng)取小腸組織0.1 g，用組織勻漿機(jī)研磨勻漿，4 ℃離心后取組織上清液，蛋白裂解液提取蛋白，BSA蛋白定量法測(cè)定總蛋白。采用SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。完成后膜用5% BSA封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST清洗3次，每次5 min。二抗孵育1 h，TBST清洗3次，每次5 min。加入堿性磷酸脂酶顯色試劑避光顯色3 min。結(jié)合所得條帶分析apoB-48、ERK、p38、SREBP等蛋白的表達(dá)情況。

2.3 數(shù)據(jù)處理與指標(biāo)分析

3 結(jié) 果

3.1 首烏降脂湯對(duì)高血脂模型金黃地鼠的進(jìn)食量和體重的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)組與空白組相比，體重在高脂喂養(yǎng)2周后增加，有顯著性差異(P<0.01)；非諾貝特和首烏降脂湯治療組在治療3周后均能顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的體重增加(P<0.01)(圖1-B、1-D、1-E)。

各組每只鼠每天攝食量無(wú)顯著性差異，說(shuō)明各組之間體重差異與攝食量不同無(wú)關(guān)(圖1-C)。綜上，高脂飼料喂養(yǎng)可顯著增加金黃地鼠的體重，而非諾貝特和首烏降脂片治療都可以顯著改善體重的增加，這一變化與動(dòng)物攝食量無(wú)關(guān)。

3.2 首烏降脂湯對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖金黃地鼠血脂指標(biāo)的影響

為了探究首烏降脂湯對(duì)金黃地鼠高脂血癥模型的治療效果，本研究檢測(cè)各組血清中的血脂相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，陽(yáng)性藥非諾貝特治療組和首烏降脂湯治療組與高脂組相比，TC有一定下降的趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(圖2-A)。TG(P<0.01)、LDL-C(P<0.05)與模型組相比顯著下降(圖2-B、2-D)。與高脂模型組相比，非諾貝特和首烏降脂湯治療組HDL-C顯著升高(P<0.01)(圖2-C)。非諾貝特治療組AST、ALT與模型組相比均無(wú)顯著變化，首烏降脂湯治療組AST、ALT顯著降低(P<0.01)(圖2-E、2-F )。綜上，首烏降脂湯治療能夠顯著改善高脂飼料誘導(dǎo)的TG升高，HDL-C降低。并且對(duì)高脂飼料造成的肝臟損傷具有一定的修復(fù)作用。

3.3 首烏降脂湯對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖金黃地鼠血清中TNF-α、FFA、apoB-48的影響

為了探究首烏降脂湯的降脂機(jī)制，本研究測(cè)定高脂飲食誘導(dǎo)的金黃地鼠血清中FFA、TNF-α以及apoB-48的含量。結(jié)果(圖3)顯示，非諾貝特治療組(P<0.05)和首烏降脂湯治療組(P<0.01)均能顯著降低高脂飲食誘導(dǎo)的血清FFA含量增加。而非諾貝特治療對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的TNF-α和apoB-48顯著升高具有一定的降低趨勢(shì)，但不具有顯著性差異。首烏降脂湯則可以顯著降低血清TNF-α和apoB-48含量(P<0.01)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明首烏降脂湯可通過(guò)降低炎癥因子TNF-α，下調(diào)apoB-48和FFA的表達(dá)。

Figure 1 Effect of Shouwu Jiangzhi (SWJZ) on body weight and food intake of high fat diet (HFD) reduced hamsters

A:Flow design of the experiment;B:Posture of Hamsters from different groups;C-D:Food intake and body weight of hamsters from different groups;E:Increase of body weight of the different groups

CONT：Control group;HFD:Model group(High fat diet);Feno:Fenobrate;SWJZ:Shouwu Jiangzhi decoction

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

Figure 2 Effects of SWJZ on serum biochemical index of HFD-induced hamsters

A-F:Levels of TC,TG,HDL-C,LDL-C,AST and ALT in the serum of HFD-induced hamsters(TC：Total cholesterol；TG：Triglyceride；HDL-C：High density liptein cholesterol；LDL-C：Low density liptein cholesterol；AST：Aspartate aminotransferase;ALT:Alanine aminotransferase)

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

Figure 3 Effects of SWJZ on serum apoB-48,free fatly acid (FFA) and TNF-α

A -C:Level of FFA,apoB-48 and TNF-α in the serum of HFD-induced hamsters

##P<0.01vsCONT group;*P<0 .05,**P<0.01vsHFD group

3.4 首烏降脂湯可通過(guò)MAPK通路降低肥胖金黃地鼠的apoB-48

為了進(jìn)一步探究首烏降脂片降低apoB-48表達(dá)的確切藥理機(jī)制，本研究采用Western blot方法檢測(cè)了MAPK通路相關(guān)蛋白(p38、ERK、JNK)磷酸化水平與脂質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白SREBP及其下游蛋白apoB-48的表達(dá)情況。結(jié)果(圖4)顯示，與正常組相比，高脂模型組的apoB-48、p-p38、p-ERK、JNK和SREBP均升高，而首烏降脂湯治療后，這些蛋白的表達(dá)降低。以上結(jié)果顯示首烏降脂湯可能是通過(guò)TNF-α/MAPK通路下調(diào)apoB-48表達(dá)，減少小腸CM的產(chǎn)生。首烏降脂湯通過(guò)apoB-48調(diào)控金黃地鼠小腸脂質(zhì)代謝的可能機(jī)制如圖5所示。

Figure 4 Effects of SWJZ on the protein expression in small intestine of HFD-induced hamsters

Figure 5 Diagram of the mechanism of SWJZ treatment on HFD-induced hamsters

4 討 論

本研究探究了首烏降脂湯是否通過(guò)抑制TNF-α/MAPK通路，下調(diào)apoB-48的表達(dá)，改善高脂血癥的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，首烏降脂湯能夠顯著降低金黃地鼠血清中TNF-α、apoB-48和FFA的含量，表明首烏降脂湯能夠通過(guò)抑制TNF-α的表達(dá)從而降低血清apoB-48的含量；首烏降脂湯還能夠抑制小腸組織中MAPK通路相關(guān)蛋白(p38、ERK、JNK)的磷酸化，下調(diào)SREBP的蛋白表達(dá)，減少小腸中apoB-48的含量。上述結(jié)果顯示，首烏降脂湯的降脂機(jī)制可能與抑制TNF-α/MAPK通路，減少apoB-48的表達(dá)有關(guān)。有趣的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，首烏降脂湯治療組的肝臟指標(biāo)(ALT、AST)明顯優(yōu)于非諾貝特治療組和高脂模型組，提示首烏降脂湯在降脂的同時(shí)能夠改善高脂飼料引起的肝功能損傷。

TNF-α是一種脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，可上調(diào)ERK/TNF-α炎癥通路可誘導(dǎo)固醇元件調(diào)節(jié)蛋白-1c(SREBP-1c)在腸細(xì)胞中的活化[12]。這提示SREBP可能是MAPK脂質(zhì)調(diào)控通路的下游蛋白。同時(shí)，SREBP對(duì)apoB-48亦有一定的調(diào)節(jié)作用[11]。本次實(shí)驗(yàn)中，首烏降脂湯對(duì)金黃地鼠的TNF-α、MAPK通路相關(guān)蛋白、SREBP以及apoB-48均有降低作用，因此，推測(cè)其能夠通過(guò)抑制TNF-α/MAPK通路下調(diào)SREBP的表達(dá)，減少血液和小腸組織中apoB-48含量，從而達(dá)到治療高脂血癥的效果。

目前apoB-48作為降脂治療的新靶點(diǎn)，已有研究發(fā)現(xiàn)apoB-48的單克隆抗體可顯著抑制apoB-48的活性，發(fā)揮降脂作用[13]。但由于單克隆抗體價(jià)格昂貴、患者依從性差等特點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。首烏降脂湯不僅克服了單抗費(fèi)用高的缺點(diǎn)，同時(shí)，首烏降脂湯中所用到的藥材經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明都具有較好的降脂或預(yù)防心血管疾病的活性[14-19]，證明了首烏降脂湯配伍和用藥的科學(xué)性和合理性，體現(xiàn)出較好的臨床應(yīng)用前景。

本研究采用降脂效果確切的首烏降脂湯，創(chuàng)新性地提出通過(guò)抑制apoB-48(小腸吸收脂質(zhì)必需的載脂蛋白)的分泌，進(jìn)而降低血中TRL含量，發(fā)揮降脂作用的新思路。研究中將apoB-48與TNF-α和MAPK通路聯(lián)系起來(lái)，探索首烏降脂湯的降脂機(jī)制，為以后降脂藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。但本次研究缺乏對(duì)首烏降脂片物質(zhì)基礎(chǔ)的研究；同時(shí)機(jī)制研究表淺，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步補(bǔ)充，如加入MAPK通路抑制劑或在基因敲除小鼠水平上進(jìn)行反向驗(yàn)證，以及臨床研究的深入驗(yàn)證。