DC靶向適配體修飾的載銅綠假單胞菌DNA疫苗遞送系統(tǒng)的構建及體外評價

黃仕琴，石 敏，何穎娜，岳瀚勛，余 嫻*

(1重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院I期臨床試驗研究室，重慶 400010；2河北中醫(yī)學院藥學院，石家莊 050200；3重慶醫(yī)科大學藥學院生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶 400010)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是引起醫(yī)源性感染的常見病原體之一，主要引起燒傷、囊性纖維化、免疫缺陷病人急性或慢性感染[1]。PA引起的感染通常難以治愈，原因在于其對抗生素類藥的多重耐藥性[2]。多重耐藥的PA感染引起的死亡率可達40.6%[3]，研究有效的PA疫苗成為預防PA感染的選擇之一。PA的外膜蛋白(outer membrane protein,Opr)F或I對小鼠感染模型有明確的免疫保護作用[3-4]，且Opr基因在不同血清型高度保守[5]。臨床試驗結果表明，以OprF/I為候選抗原的疫苗有良好的應用前景[6]。細胞穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)是促進樹突狀細胞(dendritic cells,DC)攝取抗原的有效方法，CPP攜帶抗原易于進入DC，繼而促進MHC Ⅰ和MHC Ⅱ類途徑提呈抗原，最終增強體液及細胞免疫[7]。1型單純皰疹病毒的間層蛋白VP22是重要的CPP之一，其能從表達細胞進入周圍未表達細胞[8]。前期已成功構建pVAX1-OprF-VP22 DNA疫苗，然而DNA疫苗在體內(nèi)易被核酸酶降解且非抗原提呈細胞優(yōu)先攝取導致其免疫效力嚴重受限是限制其臨床應用的最大難題。

近年來，藥物靶向遞送系統(tǒng)是研究熱點，而針對DNA疫苗的缺點，其理想的遞送系統(tǒng)需滿足兩個條件[9]：保護DNA疫苗不被核酸酶降解；靶向遞送DNA疫苗至抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)。因此，篩選一個與靶細胞受體特異性和親和力高的抗體或配體十分必要?；诤怂岬倪m配體是抗體的非蛋白替代品，其除了具有與抗體相似的高特異性和高親和力之外，還具有許多優(yōu)于抗體的特性：相對分子質(zhì)量小，無毒性及免疫原性，易于體外篩選及合成等[10]。

適配體靶向遞送抗原至DC已有相關研究報道[11]。其中，DEC-205是研究最多的DC特異性受體之一，在人、鼠間序列保守[12]，主要在皮膚朗格漢斯細胞、脾臟及淋巴結的CD8+DC表面高度表達。DEC-205介導DC對抗原的攝取、加工及提呈[13]，靶向DEC-205可使MHC Ⅰ及MHC Ⅱ類途徑抗原提呈分別提高1 000及300倍[11]。Wengerter等[14]篩選出鼠DEC-205的RNA適配體min.2，該適配體能顯著增強CD8+T細胞的增殖，促進IFN-γ、IL-2的分泌，并抑制表達OVA B16腫瘤細胞的增殖。然而，min.2用于靶向遞送DNA疫苗的研究還未見報道，本研究通過制備一種適配體修飾的DC靶向載pVAX1-OprF-VP22 DNA 疫苗的陽離子脂質(zhì)體并對其進行體外評價，為PA感染的預防提供新的思路。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

RNA適配體5Cy3-min.2(min.2序列5′標記Cy3)、RNA適配體5S-min.2(min.2 5′標記-SH)(上海生工生物有限公司)，序列詳述于表1；DOTAP、膽固醇、MPEG-2000-DSPE、DSPE-PEG2000-MAL(上海艾維特有限公司)；聚乙烯亞胺(polyethyleninime,PEI,美國Polysciences公司)；pEGFP-N2及pVAX1-OprF-VP22由本實驗室保存。小鼠骨髓來源的樹突狀細胞系DC2.4、中國倉鼠卵巢細胞CHO(華拓生物有限公司)；MEM細胞培養(yǎng)基、NEAA(美國Gibco公司)；DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及CCK-8試劑盒(賽米克生物有限公司)；重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant mouse granulocyte macrophagecolony stimulating factor,rmGM-CSF)、重組小鼠IL-4(recombinant mouse IL-4,rmIL-4,美國PeproTec公司)；RIPA裂解液、PMSF、ECL發(fā)光液、β-Actin兔單克隆抗體(碧云天生物有限公司)；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、Alexa Fluor488標記的羊抗兔IgG(北京索萊寶公司)；熒光單克隆抗體FITC-CD11c、PE-MHC Ⅱ、PE-CD86、PE-CD80(美國Bio Legend公司)；OprF抗原特異性兔多克隆抗體(上海生工生物有限公司)。

Table 1 Aptamer sequences

RNA AptamerSequence5Cy3-min.25′Cy3-GGGAGGUGUGUUAGCACACGAUUCAUAAUCAGCUACCCUCCC-inverted dT 3′5S-min.25′SH-GGGAGGUGUGUUAGCACACGAUUCAUAAUCAGCUACCCUCCC-inverted dT 3′

1.2 儀 器

Malvern激光粒徑測量儀、Malvern表面電位測量儀(美國Zetasizer公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；CytoFLEX流式細胞儀(美國貝克曼公司)；UV凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方 法

2.1 脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備陽離子脂質(zhì)體，乙醇溶解物質(zhì)的量比1∶1的膽固醇、DOTAP，55 ℃磁力攪拌下將脂質(zhì)溶液滴加到生理鹽水中攪拌1 h，冰浴下200 W超聲10 min。

2.2 Lip-pOprF-VP22、Lip-pEGFP、Apt-Lip-pOprF-VP22的制備

靜電吸附法制備負載pVAX1-OprF-VP22的陽離子脂質(zhì)體(Lip-pOprF-VP22)，按照不同的DOTAP與質(zhì)粒質(zhì)量比(DOTAP/pDNA分別為0∶0，2∶1，4∶1，5∶1，6∶1，8∶1，10∶1，pDNA質(zhì)量保持不變，僅改變DOTAP質(zhì)量)，將pVAX1-OprF-VP22與陽離子脂質(zhì)體渦旋混合后室溫反應1 h，加入MPEG-2000-DSPE(DOTAP/MPEG-2000-DSPE，3∶1)60 ℃水浴15 min，冷卻，即制得Lip-pOprF-VP22。同法制備負載pEGFP-N2的陽離子脂質(zhì)體(Lip-pEGFP)。采用后插法[15]制備適配體5S-min.2修飾的Lip-pOprF-VP22(Apt-Lip-pOprF-VP22)，即將上述反應中的MPEG-2000-DSPE替換為DSPE-PEG2000-MAL得到MAL基團修飾的Lip-pOprF-VP22(MAL-Lip-pOprF-VP22)后，加入適配體5S-min.2(5S-min.2預先在70 ℃變性3 min 后在室溫下復性15 min)，N2保護下20 ℃反應過夜。

2.3 瓊脂糖凝膠阻滯分析

將Lip-pOprF-VP22進行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，UV凝膠成像儀中觀察DNA遷移情況。

2.4 CCK-8法檢測不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比Lip-pOprF-VP22的細胞毒性

使用EMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)DC2.4細胞，于96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，以不加Lip-pOprF-VP22為空白對照，其余各組中加入不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pOprF-VP22，每組均設3個復孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，測定450 nm處的吸收度。

2.5 不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pEGFP體外轉染效果

將DC2.4細胞接種于24孔板中，以PBS為空白對照，PEI為陽性對照(PEI與pDNA質(zhì)量比為3∶1，后續(xù)實驗均采用該比例)，其余各組中加入不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pEGFP 100 μL，每組均設2個復孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察24 h、48 h各組的熒光強度。

2.6 Lip-pOprF-VP22的粒徑、電位及多分散性檢測

將適量的DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1的復合物稀釋在無菌去離子水1 mL中，測定其粒徑及電位。

2.7 適配體的靶向性驗證

以CHO細胞為DEC-205陰性表達細胞，DC2.4細胞為DEC-205陽性表達細胞。細胞接種于6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)6 h至細胞貼壁，各組分別加入5Cy3-min.2(適配體預先在70 ℃變性3 min，室溫下復性15 min)5 μL，每組均設2個復孔。37 ℃、5%CO2孵育0.5、2、4 h，PBS潤洗孔板3次，熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

2.8 免疫熒光法檢測OprF-VP22抗原蛋白的表達

將DC2.4細胞接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，以PBS為空白對照，PEI為陽性對照，實驗組分別加入 DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1的Lip-pOprF-VP22、Apt-Lip-pOprF-VP22 100 μL，每組均設2個復孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。4組細胞分別于轉染后48 h進行免疫熒光染色，具體步驟為：吸去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗3次，5% BSA 37 ℃封閉30 min，用OprF抗原特異性抗體兔多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日用PBS沖洗3次，Alexa Fluor488標記的羊抗兔IgG抗體 37 ℃避光孵育1 h，PBS沖洗3次，DAPI染核8 min，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

2.9 Western blot檢測OprF-VP22抗原蛋白的表達

將DC2.4細胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，按方法“2.8”項分組。4組細胞分別于轉染后48 h用RIPA裂解液裂解，收集各組細胞裂解液，加入上樣緩沖液煮沸10 min，采用BCA法測定蛋白濃度，常規(guī)方法進行Western blot實驗，最后使用HRP化學發(fā)光試劑(ECL)將清洗好的PVDF膜顯影，檢測蛋白條帶。

2.10 體外Apt-Lip-pOprF-VP22對小鼠BMDCs成熟的影響

2.10.1 BMDCs的誘導培養(yǎng)及鑒定 頸椎脫臼處死6～8周齡的C57BL雄性小鼠，按文獻所述方法收集BMDCs[16]，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7 d后收集到的疏松貼壁細胞即為未成熟小鼠骨髓來源樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)。含2% FBS的PBS洗滌并重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為每毫升1.0×106，加入FITC-CD11c 0.5 μL,4 ℃避光孵育30 min后用含2% FBS的PBS洗滌 3次，預冷PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。

2.10.2 Apt-Lip-pOprF-VP22對BMDCs成熟的影響 未成熟BMDCs(每毫升1.0×106個)接種于6孔板中，每孔加入含添加了20 ng/mL rmGM-CSF和20 ng/mL rmIL-4的RPMI 1640 完全培養(yǎng)基2 mL。分別加入Apt-lip(不載pDNA)、Lip-pOprF-VP22、Apt-Lip-pOprF-VP22到培養(yǎng)孔，另設置PBS空白對照與LPS(1 μg/mL)陽性對照，每組均設3個復孔，將各組細胞放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。將每孔細胞分8組：陰性對照、FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86、PE-MHC Ⅱ、FITC-CD11c+ PE-CD80、FITC-CD11c+PE-CD86、FITC-CD11c+PE-MHC Ⅱ。按前述方法標記抗體，并送流式細胞儀檢測。

2.11 統(tǒng)計學處理

3 結 果

3.1 瓊脂糖凝膠阻滯分析

采用瓊脂糖凝膠阻滯實驗觀察不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pOprF-VP22對pVAX1-OprF-VP22的包封效果。圖1可見，隨著DOTAP/pDNA質(zhì)量比的增加，脂質(zhì)體抑制DNA流動的性能增強，即脂質(zhì)體對pVAX1-OprF-VP22的包封效果增強，當DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1時即可完全抑制pVAX1-OprF-VP22的流動，達到最佳的包封效果。

Figure 1 Encapsulation effect of Lip-pOprF-VP22 with different mass ratios of DOTAP/pDNA on pVAX1-OprF-VP22

3.2 不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比Lip-pOprF-VP22的細胞毒性

采用CCK-8法檢測不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pOprF-VP22對DC2.4的細胞毒性。圖2可見，隨著DOTAP/pDNA質(zhì)量比的增加，不同復合物處理24、48 h后，各復合物對細胞存活率幾乎無影響(P>0.05)，細胞存活率均在80%以上，說明該脂質(zhì)體復合物細胞毒性低，是一種生物相容性較好的基因遞送載體。

3.3 不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比的Lip-pEGFP體外轉染效果

使用熒光顯微鏡觀察不同DOTAP/pDNA質(zhì)量比Lip-pEGFP對DC2.4細胞的轉染效果。圖3結果表明，當DOTAP/pDNA質(zhì)量比從2∶1增加至 10∶1，Lip-pEGFP對DC2.4細胞的轉染率先增加后降低，當DOTAP/pDNA質(zhì)量比為4∶1、5∶1時，Lip-pEGFP 的熒光強度較高，說明轉染率相對較高；而轉染48 h較轉染24 h的熒光更強，轉染效率更好。

3.4 Lip-pOprF-VP22的粒徑、電位及多分散性檢測

上述實驗結果表明DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1時，Lip-pOprF-VP22對pVAX1-OprF-VP22的包封效果最佳且細胞毒性低、轉染率較高。因此對該比例的DOTAP/pDNA復合物進行表征，載或不載pVAX1-OprF-VP22陽離子脂質(zhì)體的平均粒徑、Zeta電位及PDI測定結果見表2和圖4，符合基因遞送條件[17]。

3.5 適配體的靶向性驗證

為了驗證實驗所選的適配體對DC具有特異的靶向性，采用熒光顯微鏡觀察min.2與DC2.4的結合能力。圖5表明，當5Cy3-min.2適配體與不同細胞孵育2 或4 h時，DC2.4組能觀察到更多的紅色熒光，而CHO組幾乎不能觀察到紅色熒光，說明RNA適配體min.2具有較好的DC靶向性。

Figure 3 Transfection effects of Lip-pEGFP with different mass ratios of DOTAP/pDNA to DC2.4 for 24 hours (A) and for 48 hours (B)

Table 2 Particle size,PDI and Zeta potential of different liposome complexes (the mass ratio of DOTAP/pDNA is 5∶1)

GroupSize/nmPDIZeta/mVLiposome184.4±5.300.36161.00±1.68Lip-pOprF-VP22171.7±1.270.11811.30±0.570

Figure 4 Particle size (A) and Zeta potential (B) distribution of Lip-pOprF-VP22 when the mass ratio of DOTAP/pDNA was 5∶1

Figure 5 Verification the targeting properties of min.2 (×100)

3.6 OprF-VP22抗原蛋白的表達

采用免疫熒光及Western blot檢測不同復合物轉染DC2.4后OprF-VP22蛋白的表達。圖6-A表明，與PBS組相比，Lip-pOprF-VP22組和Apt-Lip-pOprF-VP22組均有較強的綠色熒光，但Apt-Lip-pOprF-VP22組熒光強度更大。這表明通過適配體對DC的靶向作用，Apt-Lip-pOprF-VP22組中更多OprF-VP22基因進入胞內(nèi)并成功表達OprF-VP22蛋白。同樣，Western blot實驗也進一步印證了免疫熒光結果(圖6-B)。

Figure 6 Immunofluorescence assay (×200) (A) and Western blot assay (B) for expression of OprF-VP22 antigen protein

3.7 體外Apt-Lip-pOprF-VP22對小鼠BMDCs成熟的影響

3.7.1 BMDCs的誘導培養(yǎng)及鑒定 CD11c是小鼠BMDCs的特征性表面分子，通過觀察細胞形態(tài)及檢測CD11c的表達量，可以反映出骨髓中誘導的BMDCs的數(shù)量。由圖7-A、7-B可知，未成熟的樹突狀細胞(immature DCs,imDCs)聚集成簇，貼壁不牢；成熟的樹突狀細胞(mature DCs,mDCs)懸浮生長，單細胞成毛刺狀、出現(xiàn)典型的樹突樣突起。圖7-C、7-D流式細胞儀分析出的表達CD11c的細胞數(shù)量約占70%，即表明通過骨髓造血干細胞分化出的DC數(shù)量約占70%。

Figure 7 photomicrograph of immature dendritic cells (imDCs) (×200) (A),photomicrograph of mature dendrtitic cells (mDCs) (×200) (B),collecting the living cell population by flow cytometry method (C) and number of cells expressing CD11c in the imDCs cell population (D)

3.7.2 Apt-Lip-pOprF-VP22對BMDCs成熟的影響 成熟的DC表面表達大量的MHC Ⅱ類分子和共刺激分子如CD80、CD86，而未成熟DC只能少量表達這些分子。MHC Ⅱ類分子、CD80和CD86是DC識別和攝取抗原必要的信號轉導分子，也是評價DC免疫功能的最佳指標。實驗中采用流式細胞術檢測上述分子在BMDCs的表達(圖8-A)。圖8-B表明，與PBS空白對照組相比，Lip-pOprF-VP22組及Apt-Lip組均不能增加CD80分子的表達；與Lip-pOprF-VP22組相比，Apt-Lip-pOprF-VP22組及LPS陽性對照組均能顯著增加CD80分子的表達，且Apt-Lip-pOprF-VP22及LPS兩組間效果無差異。圖8-C表明，與PBS組相比，Apt-Lip組不能增強CD86的表達，Lip-pOprF-VP22、Apt-Lip-pOprF-VP22及LPS各組均能增強CD86的表達；雖然LPS組與Lip-pOprF-VP22組或Apt-Lip-pOprF-VP22組相比，不能增強CD86表達，但Apt-Lip-pOprF-VP22組較Lip-pOprF-VP22組能顯著增強CD86的表達。圖8-D表明，與PBS組相比，Apt-Lip組不能增強MHC Ⅱ的表達，而Lip-pOprF-VP22組、Apt-Lip-pOprF-VP22組及LPS組均能增強MHC Ⅱ的表達；而與Lip-pOprF-VP22組相比，Apt-Lip-pOprF-VP22組及LPS陽性對照組均能顯著增加BMDCs表面MHC Ⅱ的表達，且Apt-Lip-pOprF-VP22及LPS兩組間效果無差異。上述結果說明Apt-Lip-pOprF-VP22對BMDCs的成熟效果比Lip-pOprF-VP22更顯著，其與陽性對照LPS具有相似的顯著促進作用。

4 討 論

PA是臨床上最為常見的病原體之一，研發(fā)PA疫苗是預防其感染的重要措施。課題組前期利用FDA批準的pVAX1載體構建了pVAX1-OprF-VP22融合DNA疫苗，研究證實：與OprF DNA疫苗相比，OprF/VP22融合DNA疫苗顯著增強體液、細胞免疫及免疫保護作用[4]。盡管如此，DNA疫苗在體內(nèi)易被核酸酶降解且外周DC數(shù)量少導致其特異性攝取量很低，使得DNA疫苗在體內(nèi)免疫原性低。因此，目前尚無DNA疫苗應用于臨床。

陽離子脂質(zhì)體為最常用的基因遞送載體，其可通過靜電作用與細胞膜融合而攜帶DNA分子進入胞內(nèi)，體內(nèi)外轉染效果良好。研究表明，使用陽離子脂質(zhì)體遞送DNA疫苗還可促進APC對其的攝取，激活TLR并產(chǎn)生IFN，刺激適應性免疫應答[17]。本實驗中，采用操作簡單的乙醇注入法制備陽離子脂質(zhì)體，從而避免了有機溶劑的使用，然后通過簡單的靜電吸附法成功制備Lip-pOprF-VP22。有研究者指出膠體脂質(zhì)微粒攜帶的電荷越多、空間位阻越大，穩(wěn)定性越好[18]，因此，為了增加Lip-pOprF-VP22的動力學穩(wěn)定性，本研究選用親水性的長鏈PEG修飾脂質(zhì)體，增加Lip-pOprF-VP22的空間位阻，阻止脂質(zhì)體的融合與聚集[19]；另外，通過協(xié)調(diào)陽離子脂質(zhì)與MPEG-2000-DSPE的比例，使得制備的脂質(zhì)體帶上合適的正電荷，依靠同種電荷相互排斥作用增強Lip-pOprF-VP22的動力學穩(wěn)定性。

*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsLip-pOprF-VP22 group

本實驗中制備的Lip-pOprF-VP22隨著DOTAP/pDNA質(zhì)量比增加，包封效果增強，當質(zhì)量比為5∶1時，達到最佳的包封效果(圖1)：這說明該比例下形成的復合物具有很強的靜電相互作用，因此陽離子脂質(zhì)體便可以更好地保護DNA疫苗，使得DNA疫苗在酶解前被APC內(nèi)吞。此外，在實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著DOTAP/pDNA質(zhì)量比增加，Lip-pEGFP對DC的轉染率先增加后降低(圖3)，這可能是由于Lip-pEGFP表面電荷的改變使得轉染率發(fā)生變化：即MPEG-2000-DSPE的加入使得載pDNA的Lip的表面電荷被屏蔽，隨著DOTAP/pDNA質(zhì)量比增加，MPEG-2000-DSPE的量也成比例增加，當MPEG-2000-DSPE增大到一定量時，足以屏蔽掉增加的DOTAP所攜帶的正電荷，使得表面電荷又出現(xiàn)降低的趨勢。在DOTAP/pDNA質(zhì)量比為4∶1、5∶1時，制備的脂質(zhì)體復合物轉染率高，具有作為基因載體的優(yōu)良潛質(zhì)。除具有高的轉染率外，理想的基因遞送載體還應具有良好的生物安全性[20]。其中，載體的細胞毒性是一個最重要的生物安全性指標，CCK-8實驗結果表明(圖2)，本研究制備的Lip-pOprF-VP22幾乎是安全無毒的。

通過對包封效果、轉染率、細胞毒性的評估，選取最佳DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1的Lip-pOprF-VP22進行表征并用于連接適配體。粒徑在100～200 nm帶正電荷的微粒應用于基因遞送是最合適的[21]，在DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1時，制備的Lip-pOprF-VP22粒徑約170 nm，Zeta電位約12 mV(圖4)，符合基因遞送條件。進一步通過后插法在Lip-pOprF-VP22表面修飾以DEC-205特異性的RNA適配體min.2，構建了DC靶向 PA DNA疫苗遞送系統(tǒng)。后插法可避免一步法(即將靶向配體修飾的PEG磷脂與脂質(zhì)體磷脂和膽固醇共同旋轉成膜，按照薄膜分散的方法制備靶向脂質(zhì)體)制備Apt-Lip-pOprF-VP22存在的問題：成膜不均；靶頭可存在于脂質(zhì)體內(nèi)外兩側造成靶頭的浪費。此外，后插法還可避免成膜中所用有機溶劑對配體活性的影響[22]。故而選用后插法連接適配體的方案顯得更為優(yōu)越。

在基因治療中有效的細胞內(nèi)吞和靶向能力是獲得有效治療結果的必要條件[23]，而在DNA疫苗中，抗原特異性的被APC捕獲并且內(nèi)吞進入細胞是將抗原遞呈給細胞的關鍵步驟。本研究首先證實了適配體min.2能與DC特異性結合(圖5)，具有特異性的DC靶向性能；隨后，通過免疫熒光實驗驗證了DOTAP/pDNA質(zhì)量比為5∶1時Lip-pOprF-VP22及Apt-Lip-pOprF-VP22轉染DC后OprF蛋白的表達，結果也表明Apt-Lip-pOprF-VP22有一定的DC靶向性，其能靶向DC并表達出更多OprF蛋白(圖6)；接著又探討了Lip-pOprF-VP22和min.2修飾的遞送系統(tǒng)Apt-Lip-pOprF-VP22對BMDCs成熟的影響，旨在通過對BMDCs表面成熟相關分子的表達差異來證實Apt-Lip-pOprF-VP22靶向DC后能表達出的抗原蛋白并刺激DC成熟。和預期結果一致，Lip-pOprF-VP22和Apt-Lip-pOprF-VP22均能促進DC成熟，但Apt-Lip-pOprF-VP22與LPS陽性對照相似，可更加顯著的促進DC成熟(圖8)。究其原因，DC對外來物質(zhì)的內(nèi)吞主要受特異的細胞膜受體和胞內(nèi)信號通路的調(diào)控[24]，min.2可通過與DC表面DEC-205受體結合后，在受體介導的內(nèi)吞下進入胞內(nèi)，抗原基因表達出相應的抗原蛋白促進DC成熟并活化初始T淋巴細胞，進而引發(fā)體液及細胞免疫。因此，制備的Apt-Lip-pOprF-VP22在PA DNA疫苗的研究中可能具有較好的應用潛力。

本實驗通過后插法成功制備了安全性好、DC靶向性好、促進DC成熟的PA DNA疫苗遞送載體，將進一步優(yōu)化適配體的連接比例以增強遞送載體的DC靶向性，并研究該適配體修飾的脂質(zhì)體DNA復合物的體內(nèi)靶向DC能力，通過對體內(nèi)免疫效力及免疫小鼠的PA感染率的評價來觀察該遞送載體能否增強PA DNA疫苗的體內(nèi)免疫原性，為PA DNA疫苗的研發(fā)提供新的思路。