Polo樣激酶5在調(diào)控細胞周期參與腎透明細胞癌進展和轉移的研究

梁 波,章曉軍,楊振興

(1.象山縣第一人民醫(yī)院泌尿外科，浙江寧波 315700；2.陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，重慶 400037)

近年來，隨著經(jīng)濟發(fā)展和醫(yī)療水平的提高，腎癌的發(fā)病率(66.8/100 000)和致死率(23.4/100 000)也在增加，其中大部分是腎臟細胞癌，而腎臟細胞癌中又以透明細胞癌占大多數(shù)[1]。目前，大部分腎癌患者的診斷都是通過體檢發(fā)現(xiàn)，然后再輔助精確的病理檢查，雖然局限性腎癌超過50%，但是仍然有30%的腎癌患者在診斷時就已經(jīng)轉移[2-3]。Polo樣激酶(PLK)是參與有絲分裂進入與退出，紡錘體形成，胞質(zhì)分裂和減數(shù)分裂細胞周期調(diào)節(jié)的一類激酶，在果蠅、萌芽酵母和裂殖酵母的基因組中僅發(fā)現(xiàn)一個PLK表達。然而，脊椎動物有許多PLK家族成員，包括PLK1、PLK2、PLK3、PLK4和PLK5。在脊椎動物PLK家族成員中，哺乳動物PLK1已被廣泛研究[4]。人類PLK5基因也是最近發(fā)現(xiàn)的參與細胞周期循環(huán)的關鍵激酶，在人類神經(jīng)元分化和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用[5]。并且，最近的研究顯示PLK5調(diào)控細胞周期參與腎臟透明細胞癌的淋巴結轉移[5-6]。因此，本研究將探索PLK5蛋白參與腎臟透明細胞癌發(fā)生和進展的作用機制，旨在闡述PLK5可能對腎癌轉移產(chǎn)生的潛在影響，并可能成為后續(xù)臨床用藥和治療的靶點。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 所有腎癌組織標本均來自象山縣第一人民醫(yī)院和陸軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院，參與患者均被告知參與研究，并且通過醫(yī)院倫理委員會批準。腎透明細胞癌細胞系購自上海中喬新舟生物科技有限公司；CCK-試劑盒購自日本同仁化學公司；1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司； FITC nexinV凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；PLK5抗體購自CST公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR 細胞和組織RNA的提取，在使用TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL氯仿劇烈振蕩管體15 s，15～30 ℃孵育2～3 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層及無色水相上層。加入異丙醇沉淀和提取，分離保存RNA。運用SYBR Green染料試劑盒，按照操作說明進行實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測。

1.2.2蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot) 采用Western blot檢測PLK5蛋白表達情況，步驟如下:分別收集腎癌細胞系和組織標本，使用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，冰浴20 min。離心，收集上清液，采用二喹啉甲酸法(BCA)測定蛋白水平。各組取等量總蛋白加上樣緩沖液，煮沸變性5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。然后轉移到硝酸纖維素膜上，10%脫脂奶粉封閉1 h，將對應相對分子質(zhì)量條帶剪下后分別用一抗PLK5在4 ℃孵育過夜后，加相應二抗孵育1 h，膜上滴加化學發(fā)光劑在暗室進行曝光顯影。

1.2.3免疫組織化學染色 組織標本免疫組織化學染色步驟如下:切片常規(guī)脫蠟，緩沖液PBS洗3次，每次5 min，將切片放在 Hydrogen Peroxide Block中孵育10～15 min，緩沖液洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛固定20 min，棄4%多聚甲醛后用PBS洗滌2次，滴加一抗工作液37 ℃孵育1～2 h，或抗CX43抗體的PBS-BSA (1∶200) 孵育，4 ℃過夜。向1 mL DAB Plus Substrate(或AEC Plus Substrate)中滴加1～2滴DAB Plus Chromogen(或AEC Plus Chromogen)，混勻后滴加到切片上，孵育3～15 min。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min(DAB或NBT/BCIP)，錫箔紙包裹置于37 ℃溫箱孵育1 h，PBS洗滌3次，每次3 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4慢病毒構建和轉染 慢病毒構建是由吉瑪生物公司協(xié)助完成，所有腎癌細胞系培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行孵育培養(yǎng)。六孔板細胞沒空感染20 mL慢病毒，24 h以后觀測熒光強度，進行后續(xù)試驗。

1.2.5CCK-8檢測和劃痕實驗 CCK-8檢測使用購買自碧云天的CCK8試劑盒，取對數(shù)生長期的上述腎癌細胞經(jīng)胰酶消化細胞計數(shù)后，按每孔3 000個細胞接種于96孔板中，每組設3個復孔。加入90 μL 1640培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，放細胞培養(yǎng)箱孵育1 h后，用酶標儀測450 nm波長各孔吸光度值。劃痕實驗具體步驟:先用marker筆在6孔板背后均勻地劃橫線；在孔中加入約5×105個細胞，具體數(shù)量因細胞種類不同而不同；PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；使用統(tǒng)計軟件計算細胞間距離的均值。

1.2.6流式細胞儀檢測細胞周期 OSRC2細胞經(jīng)胰酶消化后鋪6孔板，每孔2 mL培養(yǎng)基，生長至80%后經(jīng)胰酶消化收集細胞，加入預冷的75%乙醇4 ℃固定過夜，離心收集細胞，進行流失細胞儀鑒定細胞周期改變。

2 結 果

2.1PLK5基因參與腎臟透明細胞癌的進展和預后 來自癌癥數(shù)據(jù)庫TCGA的RNA-seq表達數(shù)據(jù)分析表明，腎癌患者PLK5蛋白的表達明顯高于健康對照組(n=145vs.n=22，P<0.01，圖1A)；并且這種高表達集中在腎癌的高級階段(階段Ⅳ，n=84，P<0.01，圖1B)；來自30對腎癌及癌旁組織的臨床數(shù)據(jù)也提示PLK5在腎癌患者中高表達(P<0.01，圖1C)；另外，生存分析數(shù)據(jù)也顯示，PLK5高表達者預后較低表達者差(P=0.002 2，圖1D)，特別是在PLK5高表達并且病理分級高的患者中生存率明顯降低(P<0.01，圖1E)。

2.2PLK5蛋白在腎癌細胞系和組織中的表達情況 在4種腎癌細胞系(769-P、OSRC2、786-O、Caki-2)和人正常腎臟上皮永生化細胞HK2中檢測PLK5表達情況，結果顯示，無論是Western blot(P<0.01，圖2A)還是RT-PCR(P<0.01，圖2B)實驗均表明OSRC2細胞中PLK5表達較其他細胞類型高。對臨床腎透明細胞癌患者的腫瘤及其癌旁組織的免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)，在腎臟透明細胞癌中PLK5主要表達于腎臟遠曲小管(圖2C)，且主要定位在細胞核，表達水平高，而在癌旁正常組織(圖2D)PLK5蛋白表達水平低。

A:PLK5在癌組織和癌旁組織中的RNA測序結果；B:癌癥不同分期PLK5的表達水平；C:收集的臨床標本PLK5 mRNA表達水平；C:不同表達水平患者生存曲線；D:不同表達腫瘤級別患者生存曲線；a:P<0.01，與癌旁組織/正常組織比較
圖1 PLK5與腎癌進展和預后的關系

A:Western blot檢測PLK5在腎癌細胞系統(tǒng)的表達；B:RT-PCR檢測PLK5在腎癌細胞系統(tǒng)的表達；C:腎臟透明細胞癌組織的免疫組織化染色；D:正常腎臟組織免疫組織化染色；a:P<0.01，與HK2細胞比較
圖2 PLK5蛋白在腎癌細胞系和組織中的表達

2.3RNA干擾PLK5蛋白的效率分析 構建3種PLK5干擾病毒，分別轉染腎癌細胞系OSRC2和正常腎臟上皮細胞系HK2，免疫熒光觀察顯示慢病毒感染效率高(>90%，圖3C、D)。而結果分析顯示，第3種RNA干擾標簽效果最好，無論是RT-PCR(P<0.01，圖3A)還是Western blot(P<0.01，圖3B)實驗都顯示PLK5蛋白表達水平低于其他對照組。因此后續(xù)研究均以第3類干擾RNA做分析。

A:Western blot檢測顯示3種RNA干擾效率；B:RT-PCR檢測顯示3種RNA干擾效率；C:OSRC2腎癌細胞干擾RNA-3的白光；D:OSRC2腎癌細胞干擾RNA-3的熒光；a:P<0.01，與同細胞系干擾RNA-3比較
圖3 RNA干擾PLK5蛋白表達的效率分析

2.4PLK5蛋白干擾明顯影響腎癌細胞的表型 分析PLK5蛋白干擾以后的細胞表型，CCK8細胞增殖實驗顯示，干擾組較對照組OSRC2細胞48 h以后增殖明顯減慢(P<0.01，圖4A)，而劃痕實驗也證實干擾組細胞遷移速度明顯減慢，24 h測量兩組劃痕距離有明顯差異(P<0.01，圖4B)。由于干擾后，OSRC2細胞增殖速度明顯減慢，所以隨后檢測的細胞周期也發(fā)現(xiàn)hRNA3組細胞周期阻滯在S期(P<0.01，圖4C)。

A:干擾組和對照組的CCK8增殖實驗；B:干擾組和對照組的細胞劃痕實驗；C:干擾組和對照組的細胞周期實驗；a:P<0.01，與對照組比較
圖4干擾PLK5蛋白表達對腎癌細胞表型的影響

A:22對癌組織和癌旁組織基因RNA-seq表達熱圖分析；B:GSEA分析顯示細胞循環(huán)通路中大部分基因在癌組織中被激活
圖5信號通路分析

2.5PLK5蛋白通過抑制腎癌細胞的細胞周期產(chǎn)生作用 運用癌癥TCGA數(shù)據(jù)庫中癌組織和癌旁組織(22對)的RNA-seq表達數(shù)據(jù)，在軟件基因組表達富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)中分析結果顯示，與PLK5相互作用的蛋白(圖5A)均參與了腎癌細胞的進展，這些基因均參與了細胞周期G1到S期的調(diào)控(圖5B)。明顯富集的細胞周期通路為細胞循環(huán)(cell cycle，P<0.01，F(xiàn)DRq=0.014)。

3 討 論

在當前的研究中，前期的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)PLK5蛋白在腎臟透明細胞癌患者中表達增加，尤其表現(xiàn)在腎癌的高級階段的患者中，并且生存分析顯示PLK5基因表達與患者預后密切相關，高表達患者預后明顯較差。在接下來的分子生物學實驗中，作者證實干擾PLK5基因表達可以明顯干擾細胞周期S階段，抑制腫瘤細胞增殖和遷移。

淋巴結轉移是透明細胞癌最常見的轉移方式，檢測與轉移相關的基因表達對于診斷和干預是非常有價值的[9]。盡管許多原發(fā)基因突變(如VHL、PBRM1、SETD2、BAP1等)可以導致腎癌的發(fā)生，但是哪些基因參與腎癌轉移仍然未知[3]。由于腫瘤巨大的異質(zhì)性，鑒定轉移相關的基因比較困難[10]。越來越多的證據(jù)顯示，PLK5參與腫瘤細胞的淋巴結轉移，PLK5激酶是哺乳動物體內(nèi)參與細胞循環(huán)的一類最重要的激酶，在小鼠NIH3T3細胞內(nèi)過表達PLK5 cDNA可以明顯誘導G1期靜止，增加S階段細胞循環(huán)，作為腫瘤細胞的抑制子是G1/S階段的重要調(diào)控蛋白[5，11]。PLK5基因定位在人類染色體19p13.3，全長11.4 kb，包含14個外顯子，以及PBD1和PBD2兩個主要功能域，缺乏激酶活性結構域，與PLK2和PLK3有極大同源性[5，12]。PLK5蛋白主要定位在細胞核，腫瘤細胞中PLK5表達可以抑制G1期進入S階段，并且誘導氧化應激和DNA損傷[13-14]。另外，還有研究顯示，PLK5特異的甲基化調(diào)控可以在腫瘤患者體內(nèi)控制PLK5表達，促進腫瘤細胞的增殖和遷移[15-16]。

本研究在腎臟細胞癌模型中檢測PLK5蛋白的作用，研究顯示PLK5蛋白在腫瘤細胞的表達增加可以促進腫瘤細胞增殖和遷移，與腫瘤細胞遷移有很大關聯(lián)，并且信號通路分析顯示，與PLK5相互作用的蛋白在腎癌患者中有共同的作用，所有這些研究提示PLK5蛋白與腎臟透明細胞癌的進展及預后密切相關。