GSK3β在HGF信號(hào)通路中對(duì)改善心肌缺血再灌注損傷的作用研究*

潘艷艷，史斌浩，馬夢(mèng)晴，林先和

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，合肥 230022)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVD)仍是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致患者死亡的主要原因，包括冠狀動(dòng)脈疾病、冠心病和缺血性心臟疾病，已成為全球性公共健康問(wèn)題。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高，人們生活作息和飲食習(xí)慣的改變，心肌梗死(myocardial infarction，MI)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1]。臨床上以改善缺血，盡早恢復(fù)心肌血流灌注，減少M(fèi)I面積為治療的首要原則[2]。大量研究表明，在缺血期除了細(xì)胞凋亡、壞死等促細(xì)胞死亡的機(jī)制外，還存在著細(xì)胞自噬(autophagy)等促細(xì)胞存活機(jī)制[3]。自噬是一種進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)自我保護(hù)機(jī)制，細(xì)胞內(nèi)多余的蛋白質(zhì)聚集體和受損細(xì)胞器被隔離到自噬小泡中，隨后與溶酶體融合降解[4]。在缺血狀態(tài)下，心肌細(xì)胞可以通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控自噬系統(tǒng)，自噬的發(fā)生可促進(jìn)對(duì)受損蛋白、脂質(zhì)和細(xì)胞器等廢物的清除[3]。因此，自噬被認(rèn)為是心肌細(xì)胞對(duì)抗缺血性損傷的主要保護(hù)機(jī)制。既往研究表明，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)與其受體(Met)的結(jié)合可以激活下游信號(hào)通路促進(jìn)自噬，與多種組織疾病自噬密切相關(guān)，如肺癌、結(jié)腸直腸癌、高糖性腎足細(xì)胞損傷等[5]。糖原合成激酶3β(GSK3β)是HGF下游通路中的一個(gè)重要通路蛋白，其活性的抑制可以激活多種下游通路對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷引起的炎性反應(yīng)，鈣超載和氧化應(yīng)激反應(yīng)等[6]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制GSK3β可以激活不同的信號(hào)通路，如腺苷單磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路、Beclin-1通路，可以調(diào)控多種疾病自噬[7-8]。然而，GSK3β在HGF促進(jìn)自噬對(duì)抗缺心肌血再灌注損傷中的作用少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立立體大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注模型，觀察內(nèi)源性HGF和磷酸化GSK3β(pGSK3β)的表達(dá)情況及下游通路蛋白和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，研究HGF通過(guò)促進(jìn)GSK3β的磷酸化調(diào)控自噬在減輕大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的相關(guān)作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 AMPK、肝激酶B1(LKB1)、HGF抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司)；LC3Ⅱ抗體(美國(guó)Abcam公司)；HRP-羊抗小鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、 β-actin、蛋白激酶B(Akt)抗體(上海Bioss公司)；腺病毒(上海Hanbio生物科技有限公司)；超敏型ECL發(fā)光液(美國(guó) Advansta公司)；胎牛血清(上海雙洳生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞系的選擇及培養(yǎng) 選用大鼠離體心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞系，90%高糖培養(yǎng)基(DMEM)、10%小牛血清及1%雙抗(青霉素、鏈霉素)配成的培養(yǎng)基置于37 ℃ 5%CO2環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽?實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分別為缺血再灌注(I/R)組、I/R+HGF組、I/R+HGF+Ad-GFP組(不表達(dá)GSK3β的重組腺病毒Ad-GFP)、I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組(野生型GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-wt)、I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組[表達(dá)GSK3β不可磷酸化的組成型活性突變體，其第9位絲氨酸殘基突變(Ser9)為丙氨酸，從而不能再被磷酸化失活而具有固有活性的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-S9A]和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組(表達(dá)催化失活的GSK3β復(fù)制缺陷型腺病毒載體，其第85位賴氨酸殘基突變?yōu)榧琢虬彼?，從而持續(xù)失活的GSK3β腺病毒GSK3β-Ad-K85A)。腺病毒感染方法為細(xì)胞貼壁于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，吸去原有培養(yǎng)基，加入1 mL新鮮培養(yǎng)基，選定多重感染(MOI)為100單位對(duì)應(yīng)的病毒原液體積加入細(xì)胞中，搖勻。放入37 ℃培養(yǎng)箱中感染2 h，吸去含病毒的培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入新鮮的培養(yǎng)液。HGF激活劑組加入HGF激活劑(20 ng/mL)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后更換新鮮培養(yǎng)液2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后制備I/R模型。分別吸出6組實(shí)驗(yàn)組中的完全培養(yǎng)基，加入2 mL缺血模擬液(NaCl 98.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，NaH2PO40.9 mmol/L，NaHCO36.0 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，乳酸鈉40 mmol/L，HEPES 20 mmol/L)并置于低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱(95% N2，5% CO2，37 ℃)中培養(yǎng)12 h，吸出缺血模擬液，加入2 mL完全培養(yǎng)基于普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo) 采用Western blot檢測(cè)Akt、GSK3β、LKB1、AMPK、LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)。 模型制備完后，將培養(yǎng)板置于冰盒上，用預(yù)冷的PBS清洗2次，吸盡PBS，加入裂解液搖床上裂解30 min，用細(xì)胞刮刮至1.5 mL的EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，輕輕吸取上清液加入其1/4的SDS上樣緩沖液，沸水中煮10 min，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。聚偏氟乙烯(PVDF)膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉3 h。將含有蛋白的聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于1∶1 000或1∶300的目標(biāo)蛋白抗體的一抗稀釋液中4 ℃過(guò)夜孵育，TBST沖洗3次，每次15 min，分別使用對(duì)應(yīng)的1∶10 000二抗孵育1 h，TBST沖洗3次，每次15 min。最后用超敏型ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，顯影儀Bio-Rad成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組GSK3β、pGSK3β表達(dá)情況 與對(duì)照組和I/R組比較，I/R+HGF組GSK3β的總表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而pGSK3β的表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。在HGF激活劑的刺激下，各GSK3β感染組的GSK3β的總表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組的GSK3β總表達(dá)量較低(P<0.05)。I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的pGSK3β明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

1:對(duì)照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖1 各組GSK3β、pGSK3β表達(dá)情況

2.2各組LKB1、AMPK表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，I/R組的LKB1和AMPK的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與I/R組相比，I/R+HGF組LKB1和AMPK的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。在HGF激活劑的作用下，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的LKB1和AMPK明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3各組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，I/R組LC3Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與I/R組相比，I/R+HGF組LC3Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。在HGF激活劑的作用下，I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組和I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組的LC3Ⅱ、Beclin-1明顯升高(P<0.05)，而I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

1:對(duì)照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖2 各組LKB1、AMPK表達(dá)情況

1:對(duì)照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖3 各組LC3Ⅱ、Beclin-1表達(dá)情況

2.4各組Akt表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，I/R組的pAkt(Akt的Ser473位點(diǎn)磷酸化)的表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+HGF組pAkt明顯升高(P<0.05)。而在HGF激活劑的作用下，各感染組的pAkt表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

1:對(duì)照組;2:I/R組;3:I/R+HGF組；4：I/R+HGF+Ad-GFP組；5：I/R+HGF+GSK3β-Ad-wt組；6:I/R+HGF+GSK3β-Ad-S9A組;7：I/R+HGF+GSK3β-Ad-K85A組；a：P<0.05與對(duì)照組比較；b：P<0.05，與I/R組比較；c：P<0.05，與I/R+HGF組比較

圖4 各組Akt表達(dá)情況

3 討 論

GSK3β是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸酶。GSK3β已被證明作用于多種信號(hào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡[9]。既往研究表明，GSK3β在Ser9位點(diǎn)磷酸化從而失去活性在心肌缺血再灌注引起的炎性反應(yīng)，鈣超載和氧化應(yīng)激反應(yīng)等中具有抗炎和抗凋亡作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞，其機(jī)制可能與其提高線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開(kāi)放閾值，減少線粒體損傷，細(xì)胞凋亡和壞死相關(guān)[6]。GSK3β作為HGF/Met信號(hào)通路中的一個(gè)下游信號(hào)蛋白，在HGF/Met的抗炎、抗凋亡等多種組織保護(hù)機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用[7-8]。而GSK3β在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血再灌注時(shí)HGF/Met信號(hào)通路促進(jìn)自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞中的作用，缺乏相關(guān)報(bào)道。

當(dāng)心肌發(fā)生缺血再灌注時(shí)，除心肌細(xì)胞的壞死和凋亡程度影響預(yù)后，自噬的發(fā)生同樣也影響心肌的梗死面積和存活[3]。其機(jī)制可能是當(dāng)心肌發(fā)生缺血時(shí)，細(xì)胞的能量缺乏促進(jìn)AMPK的激活，導(dǎo)致自噬基因Beclin-1的蘇氨酸388位點(diǎn)產(chǎn)生磷酸化，促使自噬基因Beclin-1與Bcl-2解離，促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和VPS34及Atg14的結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，三聚體再不斷地招募相關(guān)的核心蛋白，作為自噬起始；在自噬體的延長(zhǎng)階段，LC3Ⅰ會(huì)被包括Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系所修飾和加工，產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量為14×103的LC3Ⅱ，并定位到自噬小體中。這樣，自噬小體中存在的LC3和低分子量的LC3Ⅱ都被當(dāng)作細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志，并且LC3Ⅱ的含量和發(fā)生自噬的程度成正比。因此這兩個(gè)蛋白可以作為自噬水平的檢測(cè)指標(biāo)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠離體心肌細(xì)胞的方法使GSK3β不同的位點(diǎn)發(fā)生突變從而使GSK3β處于持續(xù)失活或激活狀態(tài)，并通過(guò)建立缺血再灌注模型，以GSK3β下游通路蛋白和自噬相關(guān)蛋白為指標(biāo)研究在HGF激活劑的作用下，GSK3β的失活對(duì)促進(jìn)細(xì)胞自噬，減輕細(xì)胞損傷的相關(guān)作用[11]。既往研究結(jié)果顯示，在缺血狀態(tài)下，HGF的激活可以激活下游PI3K/Akt/Bcl-2信號(hào)通路從而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞[12]。GSK3β作為PI3K/Akt的下游信號(hào)蛋白在缺血時(shí)同樣發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，抑制GSK3β的活性(GSK3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化)能有效提高線粒體mPTP的開(kāi)放閾值，減少線粒體損傷、細(xì)胞凋亡和壞死的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，I/R組AMPK的表達(dá)量明顯升高，驗(yàn)證了心肌細(xì)胞在發(fā)生缺血時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定量的自噬。AMPK的激活與其上游基因LKB1的活性有關(guān)。在之前的報(bào)道中表明，GSK3β去磷酸化將會(huì)抑制LKB1的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGF促進(jìn)了pAkt、pGSK3β的表達(dá)，以及下游通路蛋白LKB1、AMPK和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá)。證實(shí)了在缺血狀態(tài)下，HGF對(duì)心肌細(xì)胞自噬的促進(jìn)作用及GSK3β在HGF促進(jìn)自噬中的可能性的潛在性作用。而在HGF激活劑的作用下，GSK3β的失活(Ad-wt和Ad-K85A腺病毒感染組)使下游通路蛋白LKB1、AMPK和自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ的表達(dá)量明顯升高。表明了HGF/Met信號(hào)通路在心肌缺血再灌注損傷中通過(guò)抑制GSK3β的活性，促進(jìn)細(xì)胞自噬到達(dá)保護(hù)作用。而持續(xù)激活GSK3β的Ad-S9A腺病毒感染組中自噬呈減弱趨勢(shì)，可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞加速損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)，HGF與其受體的結(jié)合可以激活下游信號(hào)蛋白PI3K/Akt，而PI3K/Akt的激活可以促進(jìn)下游信號(hào)蛋白GSK3β在Ser9位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，失去活性[6]。在心血管系統(tǒng)中，GSK3β在葡萄糖代謝、心肌肥厚和細(xì)胞死亡等病理過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用[14]。在慢性腦缺血性疾病中，增加GSK3β的磷酸化會(huì)導(dǎo)致pmTOR的水平增加及Beclin-1水平的降低，從而抑制細(xì)胞破壞性自噬的活性。在對(duì)高糖血癥和血脂異常的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制GSK3β的活性可以通過(guò)增加AMPK的活性增加自噬體的形成，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的死亡及動(dòng)脈粥樣硬化的形成[15]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明GSK3β在HGF保護(hù)心肌對(duì)抗缺血再灌注損傷中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)從蛋白水平證實(shí)了HGF通路的激活可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞自噬保護(hù)心肌細(xì)胞在缺血再灌注中的損傷，其可能機(jī)制是PI3K/Akt/GSK3β/AMPK信號(hào)通路的激活，但其是否存在其他可能的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn)尚不明確，仍待進(jìn)一步完善。

心肌細(xì)胞是一種高度分化的永久性細(xì)胞，其損傷往往是不可逆的，會(huì)引起致命性損傷。故減少心肌細(xì)胞的損傷和死亡對(duì)保護(hù)心臟極為重要。自噬在缺血再灌注中對(duì)心肌細(xì)胞起保護(hù)作用的同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞自噬性死亡，進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞的受損。因此，避免或盡最大程度地降低自噬在缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞死亡將可能成為未來(lái)治療冠心病的重要環(huán)節(jié)。