環(huán)磷酰胺建立SD大鼠卵巢功能減退模型的研究*

李麗美，陶莉莉，和秀魁，陳小平，孫冬梅，陳玉興，夏建紅

(1.廣東省婦幼保健院婦?？?，廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，廣州 510405；3.廣東省婦幼保健院婦科，廣州 510095；4.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣州 510095)

卵巢功能減退(DOR)是一種臨床表現(xiàn)多樣、病因復(fù)雜且進行性發(fā)展的疾病。它指既往正常的卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱，卵泡的質(zhì)量下降。引起DOR的病因很多，化療是目前已經(jīng)明確的病因。環(huán)磷酰胺(CTX)是引起卵巢功能損害最大的化療藥物之一。臨床上長期周期性使用CTX，可引起月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)、早發(fā)性卵巢功能不全(POI)或卵巢早衰(POF)，停藥后一段時間月經(jīng)可恢復(fù)，恢復(fù)的時間與用藥劑量和化療的時間有關(guān)。本研究采用適當劑量的CTX建立SD雌性大鼠DOR模型，以供實驗研究使用。

1 材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實驗動物 SPF級Spragne-Dawley(SD)成年大鼠，雌性，鼠齡12周，體質(zhì)量(230±10)g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗設(shè)施合格證號和動物合格證號分別為SCXK(粵)2013-0002和NO.44007200002182。本實驗SPF級動物實驗室設(shè)施使用許可證號：SYXK(粵)2010-0059。

1.1.2實驗儀器 JJ2000動物電子秤，BS224S萬分之一電子天平，Bio-RAD 680酶標儀，YD62 型石蠟包埋機，Leica RM2235輪式切片機，Leica TP 1020型全自動脫水機，YD-AB型攤烘烤片機，YD-6L型智能冰凍包埋機，Shandon Gemini染色機，DHG-9203型電熱恒溫干燥鼓風干燥箱，Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)，702超低溫冰箱。

1.1.3實驗藥物 注射用CTX(每支0.2 g，購自山西普德藥業(yè)有限公司，批號04130301)。0.9%生理鹽水，每支10 mL。雌二醇(E2)ELISA試劑盒(批號1306246)，促卵泡激素(FSH)ELISA試劑盒(批號1306251)，促黃體生成素(LH)ELISA試劑盒(批號1304252)，抗苗勒氏激素(AMH)ELISA試劑盒(批號1304171)，抑制素B(INHB)ELISA試劑盒(批號1304261)，均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.2方法 給予大鼠標準光照(14 h光照，10 h黑夜)，全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～55%。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，行陰道脫落細胞涂片觀察其性周期變化，選取動情周期為4～5 d的大鼠120只開展實驗。將動物分為G1組(生理鹽水組，即空白對照組)和G2組，每組60只。參照劉惠芬等[1]的方法對G2組大鼠予CTX腹腔單次注射造模(按CTX 75 mg/kg的劑量加0.9%生理鹽水配成1 mL CTX藥液)，G1組予0.9%生理鹽水1 mL單次腹腔注射。兩組于腹腔注射造模后的第1、2、3、4、6、8周，斷頸處死處于動情間期的大鼠各10只。

1.3觀察指標 一般情況：每周觀察大鼠體質(zhì)量、精神、飲食、皮毛、排便及活動情況。動情周期：每天08：30取自制細棉簽蘸取0.9%生理鹽水后，輕輕在大鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)1周，行陰道涂片，用95%乙醇固定5 min，在顯微鏡下觀察細胞的種類和形態(tài)[2]。激素及細胞因子檢測：腹主動脈取血，靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清置于-80 ℃保存待測。以雙抗體夾心ELISA法測定大鼠血清中FSH、LH、E2、AMH、INHB水平，實驗步驟嚴格按試劑盒操作。卵巢指數(shù)：完整取出大鼠雙側(cè)卵巢，去掉筋膜及脂肪組織，電子天平稱質(zhì)量，將稱得的卵巢濕重分別除以體質(zhì)量，卵巢指數(shù)=卵巢濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察：稱質(zhì)量后左側(cè)卵巢置于甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，行組織形態(tài)學觀察。病理切片為連續(xù)5 μm切片，每間隔9張取1張切片(即第10張)，HE染色[1]。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 兩組大鼠觀察期間全部存活。G1組大鼠外觀體征、行為活動、精神狀態(tài)、攝食、飲水、被毛、呼吸、口、眼、鼻、耳、大小便形狀顏色等均正常。G2組大鼠給藥后出現(xiàn)被毛疏松、活動減少、精神不振、四肢無力等，第6、8周可恢復(fù)正常。

2.2動情周期 G1組大鼠陰道涂片均有規(guī)則的動情周期變化，周期4～5 d，中位數(shù)4.5 d，動情間期1.5～2.5 d，中位數(shù)2 d。G2組大鼠在CTX 造模后第1、2、3、4 周陰道涂片顯示動情周期發(fā)生改變，規(guī)則的動情周期變化消失，延長7～16 d，中位數(shù)11 d。陰道涂片顯示分泌物少，有較多散在的白細胞，少量上皮細胞，部分有少量的角化細胞和有核細胞，動情間期5～7 d，中位數(shù)6 d。造模后第6周基本恢復(fù)正常的動情周期。

2.3卵巢指數(shù) 與G1組比較，G2組大鼠卵巢指數(shù)在造模后第1、2、3、4、6周明顯降低(P<0.01)，第8周無差異(P>0.05)。G2組造模后第3、4、6周較第1周明顯降低(P<0.05),第8周較第1周無明顯變化(P>0.05)，見表1。

2.4卵巢組織 顯微鏡下G1組大鼠卵巢可清楚地分為皮質(zhì)和髓質(zhì)兩部分，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，各級卵泡及黃體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均完整，間質(zhì)腺少見，血管豐富，未發(fā)現(xiàn)間質(zhì)炎癥變化及纖維化等病變；髓質(zhì)充盈，含有豐富的神經(jīng)、淋巴管和較多的血管，未見充血、變性壞死等異常改變。G2組大鼠造模后從1周開始可見卵巢髓質(zhì)部分萎縮，皮質(zhì)明顯增生且纖維化樣變，顆粒細胞層數(shù)減少，排列疏松，甚至空泡，原始卵泡、成熟卵泡數(shù)減少，初級卵泡、次級卵泡、閉鎖卵泡增加。血管壁增厚，玻璃樣變，內(nèi)膜纖維化，肌層增厚，部分血管腔狹窄甚至消失。從第4周開始，卵巢形態(tài)開始恢復(fù)，第8周卵巢形態(tài)部分恢復(fù)，原始卵泡減少，見圖1。

2.5血清FSH、LH、E2、AMH、INHB水平 與G1組比較，G2組大鼠FSH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯升高(P<0.01)；G2組大鼠造模后第4、6、8周與第1周比較明顯降低(P<0.05)，見表2。與G1組比較，G2組大鼠LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高(P<0.01)，第8周無明顯變化(P>0.05)，見表3。G2組大鼠E2在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低(P<0.01)；G2組大鼠造模后第4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05)，見表4。與G1組比較，G2組大鼠血清AMH在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯降低(P<0.01)；G2組大鼠造模后第3、4、6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05)，見表5。G2組大鼠INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周較G1組明顯降低(P<0.01)；G2組大鼠造模后第6、8周與第1周比較明顯升高(P<0.05)，見表6。

表1 兩組大鼠卵巢指數(shù)的情況

A：G1組第1周；B：G2組第1周；C：G2組第2周；D：G2組第3周；E：G2組第4周；F：G2組第8周

圖1 不同時間卵巢組織HE染色(×40)

表2 兩組大鼠血清中FSH水平

表3 兩組大鼠血清中LH水平

表4 兩組大鼠血清中E2水平

表5 兩組大鼠血清中AMH水平

表6 兩組大鼠血清中INHB水平

3 討 論

POI是女性在40歲之前卵巢衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂(如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))伴有高促性腺激素和低雌激素為特征[3]，POI是DOR進一步發(fā)展的結(jié)果。DOR發(fā)病的危險因素包括晚生育(年齡大于35歲)、早絕經(jīng)家族史、染色體異常、FMR1基因前突變攜帶者、患有卵巢損傷性疾病(如子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎癥等)或手術(shù)史、放化療史、有吸煙嗜好等[4-5]。使用具有生殖毒性的化療藥物是引起DOR、POI、POF的一個明確病因。化療制劑對卵巢功能的影響取決于它破壞細胞的速度和能力，最早損害的是生長卵泡的顆粒細胞和卵泡膜細胞。一些化療劑特別是烷基類可以通過損害DNA來殺傷細胞，甚至是不處于增殖狀態(tài)的原始卵泡[5]。人體內(nèi) DNA修復(fù)基因隨著年齡的增長而逐漸下調(diào)表達，化療藥物還可引起這些修復(fù)基因發(fā)生突變，明顯增加化療藥物對卵泡的損傷作用而引起DOR[6]。

CTX是影響卵巢功能最大的化療藥物之一。它屬于細胞周期非特異性藥物，作用于細胞DNA而引起DNA單鏈或雙鏈的斷裂，導(dǎo)致DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成受到抑制而使卵巢功能損傷。長時間使用高劑量CTX，容易引發(fā)永久性卵巢損傷，繼而導(dǎo)致卵巢衰竭[7]。研究認為：CTX可破壞卵巢生長卵泡的顆粒細胞，使E2分泌減少，反饋引起FSH、LH升高[1]，另外CTX可使AMH、INHB表達降低，促進原始卵泡的“起始募集”，使原始卵泡向竇前卵泡發(fā)育，最終走向閉鎖[8-9]。研究還表明，CTX能同時作用于原始卵泡的卵母細胞和前顆粒細胞，干擾卵泡的成熟，耗盡原始卵泡，使卵泡損傷[10]。

DOR屬于POI、POF的前期狀態(tài)，病情相對較輕，盡早治療，卵巢功能尚有機會恢復(fù)正常。POF屬于卵巢衰竭終末期，卵巢功能基本不能逆轉(zhuǎn)。因此制造DOR動物模型要求大鼠卵巢功能有一定的損害，但又不能損害太嚴重。有學者[1]采用75 mg/kg CTX單次腹腔注射制造大鼠卵巢功能損害模型，發(fā)現(xiàn)用藥后3 d、1周、2周卵巢功能均受到一定損害，原始卵泡數(shù)目減少，引起卵巢儲備功能下降。CTX 75 mg/kg單次腹腔注射建立卵巢功能損害的大鼠模型成本低，手術(shù)操作簡便，建模成功率高，但未對AMH、INHB、LH等指標進行檢測。陳小平[11]復(fù)制了這一動物模型，發(fā)現(xiàn)用CTX 75 mg/kg單次腹腔注射造模后1、2、3、4周大鼠卵巢功能均受到一定損害,提示大鼠卵巢功能損害模型建模成功。但觀察時間短，只進行了4周的研究，對于模型是否有自我恢復(fù)能力未做進一步觀察。因此，結(jié)合前兩個實驗的優(yōu)點與不足，設(shè)計了本實驗。

本研究發(fā)現(xiàn)：在整個觀察期間，兩組造模大鼠無死亡，說明這種造模方法安全。CTX造模后1、2、3、4周動情周期延長7～16 d，動情間期延長5～7 d；卵巢組織中原始卵泡、成熟卵泡數(shù)減少，初級卵泡、次級卵泡、閉鎖卵泡增加；卵巢指數(shù)在造模后第1、2、3、4、6周明顯降低，F(xiàn)SH、LH在造模后第1、2、3、4、6周明顯升高，E2、AMH、INHB在造模后第1、2、3、4、6、8周明顯降低。表明CTX 75 mg/kg單次腹腔注射用藥建立卵巢功能損害的大鼠模型是成功的，與文獻報道一致。

造模后2周AMH較造模后1周稍有升高，造模后3周E2較造模前2周稍有升高，造模后4周INHB較造模前3周稍有升高。造模后6周大鼠恢復(fù)規(guī)律的動情周期，卵巢組織形態(tài)恢復(fù)，但

原始卵泡數(shù)減少。造模后第8周卵巢指數(shù)較前6周稍有升高。說明CTX對卵巢儲備功能損傷是肯定的，但模型有一定的自我修復(fù)能力，并未形成卵巢衰竭的狀態(tài)，符合DOR的疾病發(fā)病特點。眾所周知，卵巢功能一旦到了衰竭狀態(tài)，治療難度很大，目前尚未發(fā)現(xiàn)有藥物能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)衰竭的卵巢功能，但如果在疾病發(fā)生的早期就給予藥物干預(yù)，卵巢功能衰竭的速度可減慢，甚至有逆轉(zhuǎn)可能。

綜上所述，采用75 mg/kg CTX單次腹腔注射能成功制造SD大鼠DOR模型。該法操作簡便易行、造模時間短、成功率高，模型有一定的自我修復(fù)能力，值得推廣應(yīng)用。