呼吸道合胞體病毒感染患兒鼻黏膜拭子樣品微RNA表達(dá)

張 偉，王 燕，曾毅文，鄒國(guó)濤，羅 勇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院兒科 402160)

呼吸道合胞體病毒(respiratory syncytial virus,RSV)為包膜負(fù)單鏈RNA病毒，RSV感染好發(fā)于嬰兒期兒童，大部分患兒呈輕微上呼吸癥狀，而部分患兒將通過(guò)宿主免疫應(yīng)答發(fā)展為更嚴(yán)重的支氣管炎或肺炎[1]。因此，闡明RSV感染后患兒免疫應(yīng)答機(jī)制對(duì)于RSV預(yù)防和治療具有重要意義。微RNA(microRNA,miRNA)分子是一種長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA序列，它通過(guò)與特異性靶RNA接合抑制信使RNA(mRNA)向蛋白翻譯，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而控制炎性反應(yīng)和疾病進(jìn)展[2-3]。近年來(lái)，大量研究通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞株和臨床外周血液樣品均證實(shí)miRNA能夠調(diào)節(jié)RSV感染相關(guān)的免疫應(yīng)答[4-5]，但針對(duì)RSV感染后鼻黏膜上皮脫落細(xì)胞的miRNA表達(dá)研究較少[6]，而事實(shí)上RSV優(yōu)先感染對(duì)象為呼吸道黏膜上皮細(xì)胞[7]。因此，本研究將以RSV感染陽(yáng)性患兒鼻黏膜拭子樣品作為研究對(duì)象，分析RSV感染患兒鼻黏膜上皮脫落細(xì)胞miRNA表達(dá)譜，并進(jìn)一步分析miRNA差異表達(dá)與RSV感染導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重程度間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年9月至2018年2月RSV感染季來(lái)本院兒科門診就診兒童。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡6～12個(gè)月，初次就診，臨床表現(xiàn)咳嗽、氣促和喘息；體格檢測(cè)顯示心率、呼吸頻率加快，肺部聽(tīng)診出現(xiàn)哮鳴音或濕羅音；間接免疫熒光試劑盒檢測(cè)鼻黏膜拭子樣品呼吸道RSV抗原陽(yáng)性；其中，將胸部X線片提示支氣管炎或支氣管肺炎的RSV感染陽(yáng)性患兒作為RSV感染重度組，無(wú)影像學(xué)特征的作為RSV感染輕度組。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：相同時(shí)間段來(lái)本院進(jìn)行兒保的健康兒童，年齡6～12個(gè)月，體溫和發(fā)育正常，無(wú)既往RSV感染史和哮喘史，呼吸音清晰，RSV抗原陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期小于34周；支氣管/肺發(fā)育不良；慢性肺疾??；唐氏綜合征；神經(jīng)系統(tǒng)疾?。黄渌赡軐?dǎo)致嚴(yán)重免疫反應(yīng)的疾病類型。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，入選患兒和對(duì)照組兒童均告知監(jiān)護(hù)人并簽署知情同意書。研究共納入26例RSV陽(yáng)性患兒作為試驗(yàn)組(其中17例為輕度，9例為重度)，12例健康兒童作為對(duì)照組。試驗(yàn)組和對(duì)照組之間、RSV重度組和RSV輕度組之間在性別、年齡、身高、體質(zhì)量，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，RSV重度組和RSV輕度組病程周期差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1采樣 移除呼吸道分泌物后，將專用Miraclean鼻咽植絨拭子(深圳市麥瑞科林科技有限公司)插入兩側(cè)鼻腔中旋轉(zhuǎn)3～5圈采集鼻黏膜上皮細(xì)胞。隨后將拭子放入RNA穩(wěn)定試劑中，沖洗拭子使上皮細(xì)胞分離，-80 ℃保存待進(jìn)行miRNA分析。選擇5例對(duì)照組兒童和5例試驗(yàn)組患兒的鼻咽植絨拭子在載玻片上制成細(xì)胞涂片，用于細(xì)胞學(xué)分析。

1.2.2RNA純化分離 將-80 ℃保存的上皮細(xì)胞離心后通過(guò)TRIpure試劑(BioTeke)裂解上皮細(xì)胞，隨后使用氯仿和70%乙醇提取細(xì)胞樣品總RNA，使用mirVana TM miRNA Isolation Kit(Ambion,Austin)純化，最后采用NanoDrop 2000(Thermo)對(duì)獲得的RNA純度和完整度進(jìn)行分析。

1.2.3miRNA微陣列芯片分析 選擇2例重度，2例輕度RSV感染陽(yáng)性患兒鼻黏膜樣品和2例健康兒童樣品進(jìn)行miRNA微陣列芯片雜交。微陣列芯片使用Agilent Human miRNA芯片(V12.0)，覆蓋886種人類相關(guān)miRNA。按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方案完成標(biāo)記、雜交反應(yīng)和清洗后，通過(guò)Agilent G2565BA微陣列掃描儀(美國(guó))掃描芯片，并使用Agilent Feature extraction software v8.5對(duì)掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和評(píng)價(jià)芯片的雜交質(zhì)量。每個(gè)miRNA探針的信號(hào)強(qiáng)度采用與內(nèi)參基因信號(hào)強(qiáng)度比值表示。

1.2.4qPCR分析 通過(guò)miRNA微陣列分析選擇出對(duì)照組和試驗(yàn)組樣品中差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)26例試驗(yàn)組和12例對(duì)照組樣品進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。將樣品提取的總RNA分別用Ambion mirVanaTM miRNA和mirVanaTM qRT-PCR miRNA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分離和擴(kuò)增。采用7900 HT Fast RealTime PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,CA)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，所有引物(RT引物和PCR引物)均由Invitrogen(Thermo Fisher Scientific Corp.,CA)公司合成。qPCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 3 min 變性；95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s循環(huán),共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用ABI Prism SDS2.4 軟件分析，以內(nèi)源性管家基因U6校準(zhǔn)轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，并采用2-△△Ct方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和計(jì)算。miRNA微陣列芯片結(jié)果通過(guò)R語(yǔ)言分析，miRNA的差異表達(dá)用倍數(shù)變化方法進(jìn)行評(píng)估。以倍數(shù)變化大于或等于2視作miRNA表達(dá)上調(diào)，以倍率變化小于或等于0.5視作miRNA表達(dá)下調(diào)。miRNA微陣列芯片結(jié)果聚類分析使用分層聚類分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，試驗(yàn)組和對(duì)照組之間一般資料學(xué)統(tǒng)計(jì)采用Mann-Whitney法檢驗(yàn)。miRNA相對(duì)表達(dá)水平采用箱圖表示，試驗(yàn)組和對(duì)照組之間、RSV感染重度組和RSV感染輕度組之間miRNA表達(dá)差異比較通過(guò)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般資料比較 38例樣品總RNA質(zhì)量和數(shù)量均滿足qPCR分析需要。脫落細(xì)胞學(xué)鏡檢發(fā)現(xiàn)5例對(duì)照組兒童和5例RSV感染陽(yáng)性患兒樣品中均含有大量鱗狀和纖毛狀上皮細(xì)胞，同時(shí)含有部分粒細(xì)胞。對(duì)照組和試驗(yàn)組兩組樣品所含細(xì)胞類型無(wú)明顯差異。

表1 RSV重度組和RSV輕度組患兒miRNA表達(dá)差異的qPCR驗(yàn)證

2.2miRNA微陣列芯片分析結(jié)果 2例RSV重度患兒，2例RSV輕度患兒和2例健康兒童miRNA差異化表達(dá)熱圖如圖1所示。結(jié)果顯示試驗(yàn)組和對(duì)照組中存在24個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中15個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，9個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)；RSV輕度組患兒和RSV重度組患兒間有8個(gè)差異表達(dá)miRNA，其中RSV重度組患兒有4個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，4個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)。表達(dá)下調(diào)miRNA包括miR-34c、miR-125a、miR-31、miR-130a,表達(dá)上調(diào)miRNA包括miR-375、miR-205、miR-203a和miR-let-7f。

縱列代表不同分析樣品，橫排代表差異表達(dá)探針，紅色代表較高表達(dá)水平，藍(lán)色代表較低表達(dá)水平，白色代表相似表達(dá)水平

圖1 RSV感染導(dǎo)致鼻黏膜拭子樣品miRNA差異化表達(dá)熱圖

2.3qPCR驗(yàn)證結(jié)果 24個(gè)差異表達(dá)miRNA qPCR驗(yàn)證結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，miR-320d、miR-34b、miR-125a和miR-429表達(dá)顯著下調(diào)，miR-155、miR-203a和miR-106b表達(dá)顯著上調(diào)；RSV輕度組患兒和RSV重度組患兒間差異表達(dá)的8個(gè)miRNAs的qPCR驗(yàn)證結(jié)果如表1所示。結(jié)果顯示RSV重度組患兒miR-125a表達(dá)較RSV輕度組患兒顯著下調(diào)(P<0.05)，其余7個(gè)miRNA表達(dá)水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 RSV感染患兒鼻黏膜拭子樣品miRNA的qPCR驗(yàn)證

3 討 論

本研究首先通過(guò)miRNA微陣列芯片分析了RSV感染患兒鼻黏膜拭子樣品miRNA表達(dá)譜。通過(guò)與對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)24個(gè)差異表達(dá)miRNA。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)篩選出的24個(gè)miRNA進(jìn)行qRCR驗(yàn)證，證實(shí)有7個(gè)差異表達(dá)的miRNA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中miR-320d、miR-34b、miR-125a和miR-429表達(dá)顯著下調(diào)，而miR-155、miR-203a、miR-106b表達(dá)顯著上調(diào)。前期研究分析RSV感染患兒外周血miRNA表達(dá)譜，顯示RSV感染患兒外周血miR-106b-5p、miR-20b-5p和miR-342-3p表達(dá)上調(diào)，而 miR-320e、miR-320d,miR-877-5p,miR-122-5p和miR-92b-5p表達(dá)下調(diào)[5,8]；采用鼻黏膜拭子樣品，INCHLEY等[6]發(fā)現(xiàn)RSV陽(yáng)性患兒miR-34b、miR-34c、miR-125b、miR-29c、mir125a、miR-429和miR-27b表達(dá)下調(diào)，而miR-155,miR-31,miR-203a,miR-16和let-7d表達(dá)上調(diào)。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本研究能夠驗(yàn)證部分RSV感染陽(yáng)性患兒的miRNA表達(dá)，但也存在差異，推測(cè)其原因可能與分析樣品不同及不同生物學(xué)個(gè)體間存在miRNA表達(dá)高度異質(zhì)性有關(guān)。此外，與INCHLEY等[6]研究不同的是，本研究進(jìn)一步比較不同疾病嚴(yán)重程度患兒的miRNA表達(dá)差異，結(jié)果顯示miRNA-125a在輕、重度RSV感染陽(yáng)性患兒間表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究顯示RSV感染患兒差異表達(dá)miRNAs與宿主免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。與對(duì)照組相比，miR-320d、miR-34b、miR-125a和miR-429表達(dá)下調(diào)均超過(guò)2倍，提示這些miRNAs表達(dá)降低與RSV感染引起的宿主響應(yīng)密切相關(guān)。其中，miR-34b可能與炎癥誘導(dǎo)的呼吸道上皮細(xì)胞分化有關(guān)。有研究顯示當(dāng)IL-13和糖皮質(zhì)激素刺激培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞時(shí)，能夠調(diào)控miR-34b，且哮喘患者中支氣管上皮脫落細(xì)胞中miR-34b表達(dá)下調(diào)[9]。在注射脂多糖時(shí)，老鼠肺組織中miR-34b表達(dá)上調(diào)[10]；miR-125a已被多個(gè)研究證實(shí)與免疫系統(tǒng)中多個(gè)調(diào)控信號(hào)通路有關(guān)，包括對(duì)核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的正向調(diào)控[11]，抑制趨化因子5(CCL5)產(chǎn)生[12]，巨噬細(xì)胞激活[13]等。miR-320d在免疫系統(tǒng)報(bào)道較少，有研究顯示單純皰疹病毒1(HSV-1)感染能夠下調(diào)宿主細(xì)胞編碼的miR-320d，miR-320d通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄激活因子(RTA)調(diào)控HSV-1誘導(dǎo)的肉瘤相關(guān)皰疹病毒(KSHV)下調(diào)細(xì)胞表達(dá)[14]；miR-429被證實(shí)能夠重新激活B細(xì)胞中靜默的EB病毒[15]。INCHLEY等[6]報(bào)道RSV感染患兒miR-429表達(dá)下調(diào)。然而，miR-429在宿主免疫系統(tǒng)中的其他功能目前報(bào)道較少，其具體作用機(jī)制亟待進(jìn)一步證實(shí)。在表達(dá)上調(diào)的miRNA中，miR-106b屬于miR-17-92家族，被預(yù)測(cè)能夠靶向Tgfbr2 mRNA 影響iNKT細(xì)胞發(fā)育。miR-17-92家族表達(dá)上調(diào)可抑制轉(zhuǎn)化生化因子-β(TGF-β)信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)反應(yīng)[16]；miR-155常在樹(shù)突狀細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，并調(diào)控著這類細(xì)胞功能。miR-155由Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的NF-κB活化產(chǎn)生，正向調(diào)節(jié)髓細(xì)胞增殖和樹(shù)突狀細(xì)胞成熟，進(jìn)而調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞向淋巴結(jié)遷移和抗原呈遞。因此,miR-155表達(dá)上調(diào)總伴隨著急性的免疫反應(yīng)[17]。

當(dāng)RSV抗原與識(shí)別受體TLR4和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白1(RIG-1)結(jié)合時(shí)，激活NF-κB，進(jìn)而啟動(dòng)宿主對(duì)RSV的免疫響應(yīng)[18]。然而，過(guò)量NF-κB激活將對(duì)宿主造成有害效應(yīng)，因此對(duì)NF-κB負(fù)調(diào)控將變得十分重要。通過(guò)對(duì)RSV陽(yáng)性患兒miRNA表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)與NF-κB調(diào)控密切相關(guān)的miRNAs，包括miR-34b、miR-125a、miR-155、miR-203a。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)RSV感染后，miRNA對(duì)NF-κB的精確正、負(fù)調(diào)控在宿主免疫響應(yīng)中扮演重要作用。當(dāng)兒童感染RSV后，大多數(shù)兒童癥狀較輕，而部分患兒將進(jìn)一步進(jìn)展為支氣管炎或肺炎。因此研究RSV感染后影響病情發(fā)展相關(guān)因素具有重要意義。因此，本研究進(jìn)一步鑒別輕度和重度RSV感染陽(yáng)性患兒間miRNA表達(dá)差異，結(jié)果顯示miR-125a表達(dá)在兩組RSV患兒間存在差異，且輕度患兒表達(dá)低于重度患兒。研究顯示，miR-125a通過(guò)對(duì)TNFAIP3抑制蛋白的負(fù)調(diào)控成為NF-κB的正向調(diào)節(jié)因子，而TNFAIP3抑制蛋白為CCL5的負(fù)調(diào)控因子，也是天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要細(xì)胞因子。當(dāng)NF-κB活化后，miR-125a將在激活的人巨噬細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[19]。本研究中，RSV感染輕度患兒鼻黏膜脫落細(xì)胞中miR-125a下調(diào)可能提示巨噬細(xì)胞活化減弱或/和NF-κB信號(hào)通路被抑制，從而抑制過(guò)度的先天性免疫應(yīng)答，避免向肺炎或支氣管炎等更嚴(yán)重的臨床重度癥狀發(fā)展。

本研究通過(guò)miRNA微陣列芯片和qRCR對(duì)RSV感染患兒的鼻黏膜上皮脫落細(xì)胞miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RSV患兒miRNA譜表達(dá)模式與宿主免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，尤其包含了一系列與NF-κB調(diào)控密切相關(guān)的miRNA。其中，通過(guò)對(duì)輕、重度RSV患兒miRNA表達(dá)譜的分析，發(fā)現(xiàn) miR-125a在輕度患者中表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-125a為經(jīng)NF-κB通路的RSV免疫反應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子，其功能還待進(jìn)一步研究。此外，RSV感染患兒鼻黏膜樣品中與固有免疫反應(yīng)有關(guān)miRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài)模式也將在下一步工作中進(jìn)行研究。