人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 DNA疫苗預(yù)防NOD小鼠的機(jī)制探討

喻日成,羅建華△,楊冬花,范元碩,劉 波,呂利撒,于瑞萍

(貴州省人民醫(yī)院:1.分泌科;2.干醫(yī)科,貴陽 550002)

1型糖尿病(T1DM)為胰島β細(xì)胞特異性自身免疫性疾病,其因?yàn)樽陨砻庖吣褪苷系K，T細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)致β細(xì)胞破壞而發(fā)生。非肥胖糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠是一種遺傳性自身免疫性糖尿病動物模型[1]。NOD鼠免疫耐受障礙是因?yàn)槲闯墒鞓渫粻罴?xì)胞(iDC)和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的數(shù)量及功能缺陷所致。這些缺陷引起iDC免疫耐受效率降低，觸發(fā)持續(xù)的T細(xì)胞反應(yīng)而致病[2]。

人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)在DC功能調(diào)節(jié)上具有重要作用[3-4]，因此在體內(nèi)外通過使用GM-CSF增加和維持較高的抗iDC數(shù)量，促使產(chǎn)生外周免疫耐受，將成為一種有價(jià)值的預(yù)防自身免疫糖尿病策略。人GAD65(hGAD65)DNA疫苗成功延緩和降低了NOD鼠發(fā)生糖尿病[5]，但其預(yù)防效率仍不夠理想。迄今有關(guān)人GM-CSF DNA疫苗防治T1DM尚未見報(bào)道。我們擬用GM-CSF DNA疫苗預(yù)防NOD小鼠胰島炎和T1MD，為GM-CSF基因疫苗用于防治T1DM提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 4周齡NOD雌鼠[實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證No.006941,許可證號SCXH(滬)2007-0005]購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動物中心。在無特定病原體(SPF)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水及進(jìn)食營養(yǎng)顆粒飼料。NOD鼠群糖尿病自然發(fā)病率30周齡時(shí)約75%。

1.2主要試劑與儀器 人GM-CSF基因表達(dá)質(zhì)粒(即GM-CSF DNA疫苗，載體為pcDNA3.1)由本項(xiàng)目組構(gòu)建；質(zhì)粒提取試劑盒(HiSpeed Plasmid Midi Kit)購自德國Qiagen公司；GM-CSF購自美國Sigma公司；Hanks液和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；小鼠IL-4、IFN-γ，IL-10和IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自美國R&D公司。搖床及各種型號高速冷凍離心機(jī)為美國Beckman公司。

1.3方法

1.3.1GM-CSF質(zhì)粒的提取與質(zhì)粒DNA的純化濃縮 從含酵母、選擇性抗菌藥物的LB培養(yǎng)基劃痕平板中挑單個(gè)克隆。37 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)8 h。以選擇性LB培養(yǎng)基擴(kuò)增質(zhì)粒；37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度約3×109/mL～4×109/mL。按試劑盒操作步驟抽提質(zhì)粒，測定質(zhì)粒光密度(OD)值及濃度;在超凈臺去除乙醇，加無菌PBS溶解，濃度調(diào)至1 μg/μL。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2實(shí)驗(yàn)動物分組、免疫及發(fā)病率觀察 4周齡NOD雌鼠分為磷酸鹽緩沖液(PBS)組、質(zhì)粒載體PcDNA3.1組(PcDNA組)和GM-CS DNA疫苗組(GM組)3組，每組15只。以戊巴比妥鈉65 mg/kg麻醉NOD雌鼠，剃除小鼠脛前毛后，肌肉注射25%蔗糖100 μL,15 min后于同一部位注射PBS或溶于PBS緩沖液(pH=7.4)中的質(zhì)粒PcDNA3.1或人GM-CSF DNA疫苗，注射量為100 μg，1周重復(fù)1次，共200 μg，飼喂普通營養(yǎng)飼料。10周齡開始，測尿糖1次/周。出現(xiàn)尿糖陽性或有多飲、多尿等癥狀時(shí)，測血糖，連續(xù)2次血糖大于或等于16.7 mmol/L，則診斷為糖尿病。觀察至糖尿病發(fā)生或30周齡時(shí)處死。

1.3.3胰島病理學(xué)檢查 取10～12周齡小鼠，剪尾取血測血糖，頸椎脫臼法處死，PBS、PcDNA、GM 3組均為6只。分離胰腺，布恩氏液固定24 h,制作常規(guī)石蠟切片。切片間相隔30 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察胰島炎，由2位實(shí)驗(yàn)者采用盲法閱片。胰島淋巴細(xì)胞浸潤記分標(biāo)準(zhǔn)：胰島周圍和胰島內(nèi)無淋巴細(xì)胞浸潤記0分；胰島周圍有淋巴細(xì)胞浸潤但未侵入胰島記1分；胰島內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤小于25%記2分；胰島內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤25%～75%記3分，胰島內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤大于75%記4分[6]。每個(gè)胰腺觀察3～4張不同的切片中15～30個(gè)胰島，以胰島平均積分表示胰島炎的程度。

1.3.4NOD鼠脾細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 取1.3.3小鼠脾臟剪成2～3段捻碎,用冷Hanks液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞懸液離心(1 000 r/min)5 min,去上清液后加入6 mL的Tri-NH4Cl,混勻后室溫下放置5 min,1 000 r/min離心5 min，去上清液,以Hanks 液洗滌細(xì)胞3次(1 000 r/min離心5 min)。RPMI-1640培養(yǎng)液4～5 mL懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×106/mL。取750 μL細(xì)胞懸液至6孔板，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后,1 000 r/min離心5 min，留存上清液,收集脾細(xì)胞，均-20 ℃保存待檢測。(2)將未處理未發(fā)生糖尿病的10～12周齡NOD雌鼠(n=5)脾細(xì)胞制備懸液(方法同前述)，分別加RPMI-1640培養(yǎng)液(對照)、GM-CSF pcDNA3.1及pcDNA3.1-GM-CSF質(zhì)粒處理脾細(xì)胞備用(每孔質(zhì)粒終濃度為2 ng/mL)培育72 h，分離上清液存-20 ℃?zhèn)錂z。

1.3.5細(xì)胞因子水平檢測 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)，IL-4及IL-10水平，實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1人GM-CSF DNA疫苗對NOD雌鼠糖尿病發(fā)病率及發(fā)病時(shí)間的影響

2.1.1各組NOD鼠30周糖尿病累計(jì)發(fā)病率 PBS、PcDNA和GM 3組30周齡糖尿病累計(jì)發(fā)病率分別為80.0%、73.3%和46.7%。GM組與PBS組、PcDNA組比較，發(fā)病率分別下降了33.3%和26.6%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.128和P=0.264)。

2.1.2各組NOD鼠30周發(fā)病時(shí)間 PBS、PcDNA及GM 3組30周齡時(shí)平均發(fā)病時(shí)間分別為(143.9±46.1)、(156.9±40.0)、(188.3±30.0)d；GM組與PBS組、PcDNA組比較，發(fā)病時(shí)間顯著延遲(P=0.004和P=0.034)。

2.2人GM-CSF DNA疫苗對12周齡NOD雌鼠胰島炎的影響 PBS、PcDNA和GM 3組NOD鼠10～12周齡時(shí)胰島炎平均積分分別為(2.82±0.39)、(2.12±0.59)、(1.30±0.70)分。與PBS 和PcDNA組比較，GM組胰島炎平均積分顯著降低(P=0.001、0.026)，病理學(xué)檢查見圖1。12周齡各組NOD雌鼠胰島炎構(gòu)成比見表1。

表1 10～12周齡時(shí)NOD雌鼠胰島炎構(gòu)成比

a：P<0.05,與PBS組比較;b：P<0.05,與PcDNA組比較

A：PBS組；B：PcDNA組；C：GM-CSF組

圖1 12周齡NOD鼠胰島炎(HE染色×200)

表2 各組血清細(xì)胞因子水平

a：P<0.05,與PBS組比較;b：P<0.05，與PcDNA組比較

表3 各組脾細(xì)胞原代培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平

a：P<0.05,與PBS組比較;b：P<0.05,與PcDNA組比較

2.3血清IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平 GM組血清及上清液IL-10水平顯著高于PBS組和PcDNA組，IL-4水平顯著性高于PBS組；而IFN-γ、IL-1β水平則低于PBS組和PcDNA組。見表2、3。

2.4未處理的10～12周齡未發(fā)病NOD雌鼠脾細(xì)胞GM-CSF刺激后上清液細(xì)胞因子水平 未處理的10～12周齡未發(fā)病NOD雌鼠脾細(xì)胞GM-CSF DNA疫苗刺激后上清液IL-1β、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平較刺激前差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 未處理的10～12周齡未發(fā)病NOD雌鼠脾細(xì)胞GM-CSF刺激后上清液細(xì)胞因子水平

a：P<0.05,與對照組比較

3 討 論

用人GM-CSF DNA疫苗免疫NOD雌鼠，發(fā)現(xiàn)12周齡時(shí)GM組胰島炎積分較PBS、PcDNA組顯著性降低；GM組正常胰島比例較PBS、PcDNA組高，胰島周圍炎及胰島內(nèi)炎比例則較PBS、PcDNA組降低。提示人GM-CSF DNA疫苗可減輕NOD雌鼠胰島炎，一定程度預(yù)防和延緩NOD鼠糖尿病的發(fā)生。

T1DM為T細(xì)胞介導(dǎo)破壞β細(xì)胞的一種自身免疫疾病。CD4+T細(xì)胞在T1DM患者和NOD鼠β細(xì)胞破壞中扮演著重要角色[7]。DC是浸潤胰島的主要抗原遞呈細(xì)胞(APC)。病理性T細(xì)胞俘獲APC上的β細(xì)胞抗原[正常情況靶細(xì)胞不表達(dá)組織相溶性復(fù)合物(MHC)Ⅱ類分子]?；罨腡細(xì)胞識別APC上的β細(xì)胞抗原，并產(chǎn)生自我抗原反應(yīng)[8]。大量研究發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞是首先浸潤胰島的炎癥細(xì)胞，提示DC細(xì)胞在人類T1DM和NOD鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[9]。DC細(xì)胞通過β細(xì)胞抗原遞呈而啟動和促進(jìn)自身免疫。GM-CSF DNA疫苗減輕NOD鼠胰島炎，減少NOD鼠糖尿病的發(fā)生說明GM-CSF能通過某種途徑減輕病理性T細(xì)胞對胰島的浸潤破壞而保護(hù)β細(xì)胞，阻止NOD鼠發(fā)生糖尿病。

DC細(xì)胞對維持自身抗原的外周耐受有著重要作用。正常條件下，未成熟和未活化的DC細(xì)胞可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞活化[10]，通過與DC細(xì)胞的直接作用來維持人類和鼠正常的Treg細(xì)胞功能[11]；T1DM患者和糖尿病動物模型中DC細(xì)胞和Treg細(xì)胞功能異常，異常DC細(xì)胞和Treg細(xì)胞促使T1DM的發(fā)生。已有報(bào)道顯示，人類T1DM和NOD鼠DC 細(xì)胞功能異常，T1DM中DC細(xì)胞的正常功能減弱。NOD鼠中DC細(xì)胞不能有效活化Treg細(xì)胞，其部分原因可能與成熟障礙有關(guān)，從而病理性T細(xì)胞致β細(xì)胞免疫破壞[12]。因此，恢復(fù)DC細(xì)胞的免疫耐受和Treg細(xì)胞功能，抑制針對β細(xì)胞抗原的自身免疫反應(yīng)，保護(hù)β細(xì)胞是治療的途徑。

近來研究顯示，GM-CSF在免疫介導(dǎo)的自身免疫模型中能調(diào)節(jié)DC細(xì)胞功能，誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受[13]。其可能通過產(chǎn)生Treg細(xì)胞來誘導(dǎo)成熟-抵抗耐受的CD8a-DC細(xì)胞和抑制自身免疫反應(yīng)。GM-CSF處理早期胰島炎NOD鼠，明顯增加DC細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞，而顯著延緩糖尿病的發(fā)生，其通過CD4+CD25+Treg細(xì)胞分泌IL-10和TGF1β發(fā)生保護(hù)作用[14]。

血清及原代脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GM組IL-10顯著高于PBS、PcDNA組，而IL-1β和IFN-γ低于PBS、PcDNA組；GM-CSF刺激的脾細(xì)胞上清液中IL-10高于刺激前，IL-1β和IFN-γ低于刺激前。這說明GM-CSF能上調(diào)NOD鼠IL-10，下調(diào)IL-1β和IFN-γ，這些作用是通過脾細(xì)胞產(chǎn)生的。

GM-CSF是DC細(xì)胞的生長因子，深刻影響DC細(xì)胞的擴(kuò)增、成熟和不同亞群功能[15]。GM-CSF通過分泌IL-10的CD4+CD25+Treg細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫甲狀腺炎模型(EAT)和實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎模型(EAG)的進(jìn)展[16]。DC細(xì)胞能產(chǎn)生低濃度前炎癥細(xì)胞因子，不論細(xì)胞表面活性標(biāo)志物水平，均可促使T細(xì)胞耐受[17]。前炎癥細(xì)胞因子通過抑制Treg細(xì)胞擴(kuò)增和發(fā)展打破免疫耐受，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)下調(diào)Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能[18]，IL-1β則直接增加效應(yīng)T細(xì)胞破壞NOD鼠免疫耐受[19]。GM-CSF增加IL-Ra而影響DC的成熟，IL-Ra是外周單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β抑制劑，能活化DC細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子核因子-κB(NF-κB)[20]。GM-CSF通過下調(diào)細(xì)胞因子IL-1β和IL-12水平阻止NOD鼠發(fā)生糖尿病，這些保護(hù)作用可能是通過誘導(dǎo)DC細(xì)胞耐受及增進(jìn)Treg細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)[14]。

實(shí)驗(yàn)顯示人GM-CSF DNA疫苗可在小鼠體內(nèi)較長時(shí)間表達(dá)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，GM-CSF DNA疫苗預(yù)防和延緩糖尿病及減輕胰島炎的機(jī)制可能為：GM-CSF DNA疫苗可在NOD鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達(dá)GM-CSF，上調(diào)了IL-10和IL-4等Th2細(xì)胞因子水平，下調(diào)IFN-γ和IL-1β等Th1細(xì)胞因子水平，減輕NOD鼠胰島炎，預(yù)防和延緩NOD鼠發(fā)生糖尿病。GM-CSF DNA疫苗調(diào)節(jié)Th細(xì)胞因子尚有多個(gè)環(huán)節(jié)不清楚，如GM-CSF是如何與DC細(xì)胞發(fā)生聯(lián)系的？之后是怎樣誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌IL-10的CD4+CD25+Treg細(xì)胞等？這些均需要更深入的研究和探索，以期能揭示T1DM發(fā)病機(jī)制和尋找T1DM防治方法。