線粒體分裂/融合在高糖誘導足細胞損傷中的作用

廖奕嬌，陳奕君，何日明，劉新輝，楊曙東△

(1.廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院腎病科，廣東深圳 518033；2.廣東省深圳市中醫(yī)院腎病科 518033)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是我國終末期腎臟病(ESRD)的第二位原發(fā)病，并且其患病率和發(fā)病率均呈現(xiàn)快速增長趨勢[1]。DN患者因高糖血癥而引起腎小球基底膜增厚、系膜擴張及細胞外基質增生，使腎小球高濾過、產生蛋白尿，最終由慢性腎功能不全進展為ESRD[2]。足細胞是腎小球臟層上皮細胞，其結構的損傷及功能的改變都會影響腎小球濾過膜的通透性，是評估腎小球濾過膜通透性的重要生物標志物[3]。高糖對足細胞的損傷所導致的濾過膜屏障破壞是DN產生蛋白尿的主要原因[4]。podocin作為足細胞裂孔隔膜的主要蛋白分子，是足細胞損傷的重要標志，在維持足細胞的正常形態(tài)和功能及蛋白尿發(fā)生中起重要作用[5]。

A:未分化細胞；B:對照組；C:60 mmol/L組

圖1 足細胞形態(tài)變化(×100)

近年來的研究表明，線粒體在DN發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。線粒體是一個動態(tài)細胞器，其形態(tài)的維持依靠線粒體分裂和融合機制。線粒體分裂和融合可增加細胞應激抵抗力，分裂/融合的異常與疾病的發(fā)生密切相關[6]。然而，目前有關高糖刺激對足細胞線粒體分裂/融合影響的文獻報道甚少。本研究擬通過觀察不同濃度葡萄糖對體外培養(yǎng)的人足細胞線粒體分裂/融合相關蛋白的調控，以探討高糖誘導足細胞損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1細胞與材料

1.1.1永生化人足細胞AB8/13(英國布里斯托大學Moin A.SALEEM教授饋贈)。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液(ITS)、雙抗及胰酶(美國Gibco公司)?？贵w：足突蛋白(podocin)、線粒體融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)及Mfn2(英國Abcam公司)；線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor，Mff)、線粒體動力蛋白(MiD49，美國Proteintech公司)；視神經萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1,美國BD Biosciences公司)；二抗(CST公司)。儀器：超凈工作臺(新加坡ESCO公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；全自動凝膠成像和化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(美國ChemiDocTMMP Imaging System公司)、垂直電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1足細胞培養(yǎng) 足細胞快速復蘇后用含10%FBS、1% ITS及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于33 ℃培養(yǎng)箱中進行增殖。每1～2天換液1次。細胞生長融合至80%～90% 時用0.25% 胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]溶液消化、傳代。將一部分細胞轉移至37 ℃培養(yǎng)箱用含5% FBS及1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基誘導分化10 d后用于后續(xù)實驗。

1.2.2實驗分組 對照組：普通RPMI-1640培養(yǎng)基；高糖刺激組的葡萄糖濃度分別為30(30 mmol/L組)、45(45 mmol/L組)、60 mmol/L(60 mmol/L組)。刺激時間為48 h。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 細胞分組刺激后吸除培養(yǎng)液，以預冷的0.01 mol/L PBS洗滌2次。加入1×細胞裂解液80～100 μL/皿并均勻覆蓋，置于冰上裂解10～15 min。用細胞刮仔細刮下細胞蛋白并吸入EP管內，離心(4 ℃，12 000×g，10 min)后將上清液轉入另一EP管；電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60 min；孵育一抗、二抗，曝光顯影，圖像分析。

2 結 果

2.1足細胞形態(tài)變化 與未分化細胞相比，經過10 d分化的對照組足細胞可見足突生成(箭頭所示)。而經60 mmol/L高糖刺激48 h后足突廣泛減少甚至消失，見圖1。

A:Western blot圖；B:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖2 各組細胞podocin表達

A:Western blot圖；B、C:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖3 各組細胞線粒體分裂相關蛋白表達

A:Western blot圖；B、C、D:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖4 各組細胞線粒體融合相關蛋白表達

2.2足細胞標志蛋白podocin表達的變化 Western blot結果顯示，高糖刺激可呈濃度依賴性下調podocin表達，其中60 mmol/L組足細胞podocin蛋白表達顯著下調，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，為正常對照組0.63倍，見圖2。

2.3線粒體分裂相關蛋白表達 高糖刺激可呈濃度依賴性增加線粒體分裂相關蛋白MiD49及Mff的表達。其中，60 mmol/L組與對照組比較，MiD49表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時，60 mmol/L組Mff表達較對照組上調，表達水平為對照組的1.33倍，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4線粒體融合相關蛋白表達 各濃度的高糖刺激對足細胞線粒體融合相關蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1的表達均有一定下調作用。其中，30、45、60 mmol/L組均可顯著下調Mfn1表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4A、B。45 mmol/L組與60 mmol/L組Mfn2表達較對照組顯著下調(P<0.05)，見圖4A、C。60 mmol/L組OPA1表達較對照組顯著下調(P<0.05)，見圖4A、D。

3 討 論

DN表現(xiàn)的持續(xù)蛋白尿與足細胞裂孔隔膜密切相關，裂孔隔膜的完整性是腎小球濾過機械屏障的關鍵[7]。podocin是分布于裂孔膜的跨膜蛋白，起到細胞骨架連接橋梁作用，是防止清蛋白濾出的關鍵分子蛋白，但裂孔膜分子易受損害，一旦發(fā)生突變則會破壞腎小球濾過膜的完整性，產生大量蛋白尿[8]。國內外已有不少研究表明高糖環(huán)境下足細胞的增殖降低，出現(xiàn)podocin蛋白表達明顯下調的現(xiàn)象[9-11]。

線粒體的分裂與融合對其正常功能的發(fā)揮具有非常重要的作用，線粒體通過不斷活躍的分裂/融合可穩(wěn)定線粒體的形態(tài)及分布[12]。線粒體融合相關蛋白Mfn1、Mfn2及OPA1等，其分裂蛋白則有MiD49、Mff等。Mfn1和Mfn2是線粒體融合的關鍵介導蛋白，Mfn1主要在融合的前期促進線粒體間的彼此結合，Mfn2則主要在線粒體融合反應的后期起作用[13]。OPA1位于線粒體內膜上，具有促進線粒體融合的功能，可使嵴連接處于關閉狀態(tài)，以維持嵴的形態(tài)[14-15]。MiD49、Mff可以募集動力相關蛋白1促進線粒體裂變，且MiD49在Mff缺失的情況下，仍可推動分裂的進行[16]。本研究用不同濃度葡萄糖對足細胞作用48 h，與對照組比較，60 mmol/L的高糖刺激可引起足細胞形態(tài)結構發(fā)生明顯變化，細胞數(shù)量顯著減少，且由實驗數(shù)據可知podocin表達明顯下調。同時，由Western blot結果可知60 mmol/L高糖可上調線粒體分裂相關蛋白、下調線粒體融合相關蛋白，表明線粒體形態(tài)調控在高糖的作用下發(fā)生了明顯的變化。

綜上所述，高糖可能通過增加線粒體分裂、減少線粒體融合誘導足細胞損傷及形態(tài)異常。該研究從線粒體形態(tài)調控的角度闡明了高糖誘導足細胞損傷的機制及可能靶點，為下一步治療藥物的篩選奠定了實驗基礎。