肝纖維化炎癥微環(huán)境對間充質(zhì)干細胞Hedgehog信號通路調(diào)控的研究*

李 燦，馬 燕，劉漪淪，孫 靜，郭莉娜，譚悅浩，王航宇，劉衛(wèi)華，鄧峰美△

1.成都醫(yī)學(xué)院(成都610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 科研實驗中心(成都610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 燒傷整形科(成都610500)；4.四川省老年醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心(成都610500)；5.石河子大學(xué)(石河子832000)

間充質(zhì)干細胞(MSCs)是一類具有自我更新和分化潛能的成體干細胞，具有修復(fù)損傷和病變組織的能力。有研究證明，MSCs能夠改善多種炎癥疾病如多發(fā)性硬化癥[6-8]，移植物抗宿主病[9]，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[10],同時在改善慢性肝炎方面也具有良好的效果。然而，炎癥微環(huán)境對MSCs的刺激，可能會影響MSCs自身的性質(zhì)和功能，如自噬[11]，凋亡[12]，惡性轉(zhuǎn)化[13]。雖然目前有許多研究應(yīng)用MSCs通過抑制炎癥以改善肝纖維化，但MSCs與肝纖維化炎癥微環(huán)境相互作用的機制還不是很清楚，因此有必要探索MSCs在肝纖維化炎癥微環(huán)境中的相關(guān)分子變化。

Hedgehog信號通路在胚胎發(fā)育過程中的細胞分化和增殖起著重要作用，且在許多器官中可促進創(chuàng)傷愈合,但Hedgehog信號通路的異?；罨瘯?dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展和組織器官的纖維化[14-16]。多項研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，位于血管周圍的Gli1+的MSCs在多種器官纖維化的形成中扮演著關(guān)鍵的角色，Hedgehog通路的活化促進MSC向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，加劇纖維化的形成。此外，Bone Morphogenetic Protein 9(BMP9)屬于TGF-β超家族成員分子，可通過Hedgehog信號通路誘導(dǎo)MSCs的成骨分化[19]。Donnelly等[20]發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的促炎因子IFN-γ可通過Hedgehog信號通路促進MSCs的增殖和遷移。這些研究說明，炎性因子可能通過激活Hedgehog信號通路影響MSCs的生物特性，但這些研究僅局限于體外實驗，且所研究的炎性因子單一，不能很好反應(yīng)炎癥微環(huán)境對MSCs的Hedgehog信號通路的綜合影響。

本研究在體外構(gòu)建模擬肝纖維化炎癥微環(huán)境，并在體內(nèi)利用CCl4建立小鼠肝纖維化模型，初步研究MSCs在肝纖維化炎癥微環(huán)境中Hedgehog通路的激活情況。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康4～6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠5只，16～22 g和健康6～8周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠12只，20～25 g，購自成都達碩實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院動物實驗中心SPF級動物實驗室，光照時間12 h/d，飼養(yǎng)環(huán)境濕度為50%～60%，室內(nèi)溫度19～24 ℃。實驗操作符合成都醫(yī)學(xué)院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

Ⅰ型膠原酶(solarbio)，胎牛血清(gibco)，DMEM低糖培養(yǎng)基(BI)，雙抗(solarbio)，Gli1一抗(santa cruz)，Smo一抗(santa cruz)，GAPDH(proteinteck)， TNF-α(SB)，INF-γ(SB)，TGF-β1 (R&D systems)， SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(solarbio)，Marker(Bio-Rad)，Ripa裂解液，蛋白酶抑制劑(PMSF)，1M Tri-Hcl pH=7.5，1M Tri-Hcl pH=6.8，1.5M Tri-Hcl pH=8.8，Cy3-熒光二抗，TritonX-100，DAPI，抗熒光淬滅劑的封片液均購自碧云天公司，Sca-1-PE(BD)，CD44-APC(BD)，CD34-FITC(BD)CD45-Percp-cy5.5(BD)，地塞米松(solarbio)，β-甘油磷酸鹽，抗壞血酸，茜素紅，胰島素，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，吲哚美辛，油紅O，OCT均是購自北京索萊寶生物科技有限公司，增強型綠色熒光蛋白(EGFP)慢病毒載體(蘇州中菁)。PCR擴增引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞的原代分離培養(yǎng) 頸椎脫臼處死小鼠，取出腹部脂肪組織，用預(yù)冷的含2%雙抗的PBS反復(fù)漂洗。將脂肪組織剪成1 mm3的組織塊，加入同等體積0.1 %(mg/mL)Ⅰ型膠原酶消化液并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，37 ℃恒溫消化0.5～1 h。加入同等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，室溫下以轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑8 cm，離心8 min，去掉上清?；A(chǔ)培養(yǎng)基重懸細胞，過200目細胞篩，濾入15 mL離心管，室溫下以轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑8 cm，離心8 min。棄去上清液及懸浮的脂肪細胞，用間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液重懸細胞，按每3.5 cm培養(yǎng)皿5×105個細胞的密度接種，標(biāo)記為原代細胞(P0)。放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。 24 h后更換新鮮的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液，去除未貼壁細胞。每2～3 d換1次培養(yǎng)基。待細胞長至80%～90%融合時傳代。

1.3.2 流式細胞術(shù)檢測脂肪間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物 細胞傳至第3代，待細胞密度達到70%～80%后，預(yù)冷的PBS沖洗3次。加入1 mL0.25%胰蛋白酶37 ℃消化3 min，加入同等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化，室溫下以轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑8 cm，離心3 min，去掉上清。再加入適量預(yù)冷的PBS重懸，重復(fù)上述操作3次。將得到的細胞分為4份，平均支EP管中細胞數(shù)為2～2.5×105個，每管分別加入用PBS以1∶200比例稀釋的Sca-1-PE，CD44-APC，CD34-FITC)，CD45-Percp-cy5.5熒光一抗，室溫避光孵育1 h。室溫下以轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心半徑8 cm，離心5 min，，棄上清，加入預(yù)冷PBS重懸，上述操作重復(fù)3次。最后離心后的每管細胞使用500 μL PBS重懸，上流式細胞儀進行檢測。

1.3.3 脂肪間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化 成骨誘導(dǎo)：取培養(yǎng)第3代的細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以1×104/cm2密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至70%，吸棄培養(yǎng)液，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清，0.1 μM地塞米松，50 μM抗壞血酸，10 mM β-甘油磷酸鈉的低糖DMEM培養(yǎng)基)，以加含體積分數(shù)10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基為對照組，每3 d換液1次。誘導(dǎo)約21 d后，吸棄上清液，加入10%中性甲醛固定30 min，再加入體積分數(shù)1%茜素紅染液，室溫下染色3～5 min后，用自來水沖洗，并在倒置相差顯微鏡下觀察。成脂誘導(dǎo)：取培養(yǎng)第3代的細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，以5×103/cm2密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞長至70%，吸棄培養(yǎng)液，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含體積分數(shù)10%胎牛血清，1 μM地塞米松，10 μg/mL胰島素，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.2 mM吲哚美辛的低糖DMEM培養(yǎng)基)，以加含體積分數(shù)10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基為對照組，隔天換液。誘導(dǎo)約21 d后，吸棄上清液，加入10%中性甲醛固定30 min，再加入油紅染液，室溫下染色4～5 min后，自來水沖洗，并在倒置相差顯微鏡下觀察。

1.3.4 ADMSCs慢病毒轉(zhuǎn)染 將ADMSCs以1.5×104/孔的密度接種于含有細胞爬片的24孔板中，冰浴融化慢病毒，吸去細胞原有培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒液加入細胞中，37 ℃培養(yǎng)48 h后，吸除含慢病毒的培養(yǎng)基，換為新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率(即綠色熒光細胞數(shù)量百分比)。使用嘌呤霉素(pruomycin)篩選，最后得到帶有綠色熒光的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。

1.3.5 小鼠肝纖維化模型制備 選擇12只6～7周齡的雄性小鼠，平均分為兩組：實驗組(CCl4)和對照組(橄欖油)，每組6只。實驗組小鼠經(jīng)腹腔注射10% CCl4劑量為4 mL/kg，每周兩次，共5周，用于制備肝纖維化小鼠模型，對照組腹腔注射同等劑量的橄欖油。

1.3.6 Western blot方法檢測蛋白表達 實驗組ADMSCs經(jīng)炎性因子(TNF-α (20 ng/mL)，IFN-γ (50 ng/mL)和TGF-β1 (10 ng/mL)聯(lián)合)處理12 h，對照組ADMSCs(加入與實驗組等體積PBS)，收集細胞，加入細胞裂解液裂解，采用BCA 法測定蛋白濃度。取30 μg 細胞總蛋白上樣電泳10% SDS-PAGE，0.45 μm PVDF膜恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h。室溫5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗(Gli1 1∶300；Smo 1∶300；GAPDH 1∶5 000) ，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次。二抗(山羊抗兔、抗小鼠均1∶3 000稀釋) 室溫孵育1 h。TBST 洗膜5 min×3次。滴加ECL，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。實驗重復(fù)3 次。

1.3.7 免疫熒光檢測蛋白表達 體外實驗：將ADMSCs以1×104/孔的密度接種于含有細胞爬片的24孔板中，實驗組ADMSCs經(jīng)炎性因子處理，對照組ADMSCs(加入與實驗組等體積PBS)，培養(yǎng)12 h。體內(nèi)實驗：實驗組和對照組小鼠(n= 6)每只小鼠尾靜脈注射5×105個EGFP-ADMSCs，3 d后安樂死，取肝臟及脾臟，OCT包埋制作冰凍切片。肝臟冰凍切片和細胞爬片均使用10%中性甲醛室溫固定30 min，PBS洗5 min×3次，0.5% TritonX-100室溫通透15 min，PBS洗5 min×3次。5%山羊血清室溫固定1 h，一抗(Gli1 1∶300；Smo 1∶300)孵育，4 ℃過夜。PBS洗5 min×3次，加Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔的熒光二抗(1∶500)，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3 min×3次，加DAPI染核5 min，洗3 min×3次。用抗熒光淬滅劑的封片液封固。熒光顯微鏡下觀察并拍照。實驗重復(fù)3 次。

1.3.8 qRT-PCR檢測mRNA表達 處理方式同1.2.4，總RNA提取試劑盒(索萊寶) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA (逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Bio-Rad)，以此cDNA為模板用熒光定量PCR試劑盒 (Bio-Rad) 進行擴增。實驗操作均按相應(yīng)試劑盒說明書進行。引物由上海生工設(shè)計合成。引物序列，Gli1: 上游5'-ATCACCTGTTGGGGATGCTGGAT-3'，下游5'-CGTGAATAGGACTTCCGACAG-3'。Smo: 上游5'-TGCCACCAGAAGAACAAGCCA-3'，下游5'-CCTCCATTAGGTTAGTGCGG-3'; GAPDH: 上游5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' ，下游5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。qRT-PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，62 ℃退火延伸30 s，循環(huán)35次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組基因相對表達量。各組均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 脂肪間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)

從C57BL/6小鼠睪丸上方白色脂肪中分離獲得細胞，接種于一次性培養(yǎng)瓶中。3 d后首次全換液時可見培養(yǎng)瓶有部分細胞貼壁；5 d后貼壁細胞增多達到50%，僅見少量漂浮的不貼壁懸浮生長細胞在培養(yǎng)液內(nèi)(圖1A)；7 d貼壁細胞胞體明顯增大，細胞形態(tài)由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較多，折光性差，核變大且清楚見1～2個核仁(圖1B)；10 d時貼壁細胞形態(tài)基本一致，呈現(xiàn)漩渦狀排列，細胞胞體扁平，胞體狹長，細胞核為橢圓形，此時達到細胞融合度達到90%以上(圖1C)。

圖1脂肪間充質(zhì)干細胞分離及培養(yǎng)(×100)
注：A、B、C分別為：間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)5、7、10 d

2.2 脂肪間充質(zhì)干細胞表面抗原表達和分化潛能鑒定

流式細胞儀鑒定第3代脂肪間充質(zhì)干細胞的結(jié)果顯示了CD44，Sca-1呈陽性分別為97.2%、57.4%。CD34，CD45呈陰性分別為0.5%、0.6%(圖2)。脂肪間充質(zhì)干細胞經(jīng)過成骨、成脂誘導(dǎo)，培養(yǎng)21 d后細胞出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)和脂滴(圖3)。

圖2 脂肪間充質(zhì)干細胞表面抗原

注：A:陽性標(biāo)記Sca-1；B：陽性標(biāo)記CD44；C：陰性標(biāo)記CD34；D：陰性標(biāo)記CD45

圖3 脂肪間充質(zhì)干細胞多向分化潛能注：A：間充質(zhì)干細胞成骨分化，×100；B：間充質(zhì)干細胞成脂分化×400

2.3 肝纖維化炎性因子能上調(diào)Gli1及Smo mRNA和蛋白的表達

qRT-PCR和Western blot實驗結(jié)果表明，與對照組相比，肝纖維化炎性因子處理ADMSCs，可明顯上調(diào)Gli1(1.00±0.00 vs 3.71±0.48,P<0.001)和Smo(1.00±0.00 vs 2.54±0.039,P=0.002)mRNA表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且上調(diào)Gli1(1.00±0.00 vs 1.77±0.11,P<0.001)和Smo(1.00±0.00 vs 1.59±0.22,P=0.010)蛋白表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)；免疫熒光實驗也表明肝纖維化炎性因子處理ADMSCs后，可明顯上調(diào)Gli1(2.56±0.69 vs 5.79±1.52,P=0.001)及Smo(1.40±0.34 vs 4.28±1.53,P=0.001)蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖4 Western blot 檢測炎性因子對ADMSCs的Gli1及Smo mRNA和蛋白表達的影響注：A：Western blot檢測ADMSCs Smo及Glil蛋白表達；B：qPCR檢測ADMSCs Glil mRNA表達：C：qPCR檢測ADMSCs Smo mRNA表達

圖5 熒光顯微鏡下觀察檢測炎性因子對ADMSCs的Gli1及Smo 表達的影響(×400)注：A:細胞免疫熒光檢測ADMSCs Glil蛋白表達；B：細胞免疫熒光檢測ADMSCs Smo蛋白表達

2.4 肝纖維化炎癥微環(huán)境能上調(diào)ADMSCs中Gli1及Smo蛋白的表達

肝纖維化小鼠和對照小鼠通過尾靜脈注射等量的EGFP-ADMSCs，72 h后發(fā)現(xiàn)大量的EGFP-ADMSCs聚集在對照組小鼠和實驗組小鼠的脾臟中，兩組脾臟聚集的細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(832.70±41.50 vs 787.7±90.97,P=0.479)；然而，在試驗組(肝纖維化)小鼠的肝臟較對照組小鼠肝臟聚集更大量的EGFP-ADMSCs(408.30±55.48 vs 43.00±17.06,P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其主要分布在纖維增生區(qū)域，而對照組小鼠卻很少見，且均勻分布在肝臟中(圖6)。組織免疫熒光實驗表明肝纖維化小鼠的肝臟中ADMSCs，比對照組小鼠明顯上調(diào)Gli1(0.19±0.07 vs 1.31±0.28,P<0.001)及Smo(0.004±0.001 vs 1.37±0.97,P=0.006)蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖7)。

圖6 熒光顯微鏡下觀察EGFP-ADMSCs在肝臟及脾臟中聚集數(shù)量(A1、A2：×10;A3、A4：×100)注：A：熒光顯微鏡下觀察肝臟及脾臟中聚集的EGFP-AMDSCs;B：統(tǒng)計肝臟及脾臟中聚集的EGFP-ADMSCs數(shù)量，***P<0.001

圖7 熒光顯微鏡下觀察肝臟中ADMSCs的Gli1及Smo 表達(×200)注：A：組織免疫熒光檢測EGFP-ADMSCs Glil蛋白表達；B：組織免疫熒光檢測EGFP-ADMScs Smo蛋白表達

3 討論

肝臟作為次級淋巴組織，擁有獨特的免疫功能。肝臟受損傷時，肝內(nèi)定居的固有免疫細胞的活化能分泌大量的炎癥介質(zhì)，以及其他細胞類群表達趨化因子和黏附分子。研究[21-22]表明，肝庫普弗細胞是體內(nèi)固定型巨噬細胞中最大的細胞群體，肝臟受損后，庫普佛細胞和血液系統(tǒng)中的單核細胞會趨化到局部的肝損傷區(qū)域，清除異物及細胞碎片，同時分泌大量的炎性因子如TNF-α、TGF-β1、IL-1，激活鄰近的肝星狀細胞，促進肝纖維化。肝臟中定居著大量的淋巴細胞，維持著肝臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)HSCs活化后，趨化至損傷區(qū)域的淋巴細胞如NK、NKT細胞等則會分泌IFN-γ通過不同的機制促進HSCs發(fā)生凋亡，抑制其活化，從而抑制肝纖維化的形成[23-24]。此外，激活后的肝星狀細胞(即肌成纖維細胞)自分泌TGF-β1、TNF-α、FGF等[25-26]，進一步刺激鄰近的肝星狀細胞激活轉(zhuǎn)化，從而使肝星狀細胞呈現(xiàn)瀑布樣激活效應(yīng)，維持肝纖維化的形成過程。TNF-α，IFN-γ和TGF-β1貫穿與肝纖維化形成始終，促進肝纖維化炎癥微環(huán)境的形成。

本研究使用TNF-α，IFN-γ和TGF-β1協(xié)同作用的方式構(gòu)建模擬體內(nèi)肝纖維化炎癥微環(huán)境。體外結(jié)果顯示，實驗組的MSCs的Gli1和Smo mRNA及蛋白表達高于對照組(P<0.05)。本研究篩選由增強型綠色熒光蛋白慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)ADMSCs，用于細胞的體內(nèi)示蹤。通過小鼠尾靜脈注射到對照小鼠和肝纖維化小鼠體內(nèi)，3 d處死小鼠后發(fā)現(xiàn)，對照組和實驗組小鼠脾臟中聚集大量的EGFP-MSCs，細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。然而，肝纖維化小鼠的肝臟中EGFP-MSCs數(shù)量遠遠多于對照小鼠(P<0.05)，并且在肝纖維化小鼠肝臟中的EGFP-MSCs主要分布在匯管區(qū)以及纖維增生區(qū)域，這些區(qū)域均是肝臟的受損部位，可能提示外源的MSCs可能受到一些趨化因子的作用，遷移至肝臟受損部位進行修復(fù)。對照小鼠肝臟未受到損傷，大量的細胞在脾臟聚集，因而遷移至肝臟中的EGFP-MSCs很少。這些結(jié)果證實，可能肝纖維化炎癥微環(huán)境的形成對MSCs的遷移具有重要的意義。

目前有研究[27-28]證明，MSCs能夠通過分泌多種免疫抑制分子抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而抑制炎癥，改善肝纖維化。但MSCs的功能同時也受到炎癥因子的影響，一方面MSCs的免疫抑制功能的發(fā)揮有賴于炎性因子的刺激，另一方面炎癥因子也會促進MSCs增殖、凋亡，甚至發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變[12-13]。Hedgehog信號通路對細胞的命運的調(diào)控起著重要的作用，包括增殖，凋亡，遷移和分化[29]。正常狀態(tài)下, Hedgehog信號通路對胚胎發(fā)育、干細胞自穩(wěn)態(tài)、細胞分化、組織極化和細胞增殖等過程起著重要的調(diào)控作用。Smo是一個7次跨膜的膜蛋白，Smo將活化信號從胞膜傳遞入胞質(zhì)中。Gli1作為hedgehog信號通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，活化的Gli1以全場的形式進入細胞核內(nèi)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活子的功能，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。Gli1也可通過非經(jīng)典途徑活化。有研究[29]證明，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)能通過非經(jīng)典的方式直接促進Gli1的活化、入核，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究顯示，炎性因子組比對照PBS組的ADMSCs Smo和Gli1表達升高，證明肝纖維化炎性因子對MSCs的hedgehog信號通路的激活可能是通過Smo-Gli1的經(jīng)典途徑實現(xiàn)的。

2018年國內(nèi)干細胞臨床研究備案項目新增19個，這意味著我國干細胞臨床試驗進入飛速發(fā)展的階段。細胞療法帶來益處的同時，其本身的安全性問題也不容忽視。應(yīng)用細胞療法治療疾病的同時也要預(yù)防治療中所使用的細胞向惡性細胞轉(zhuǎn)變或產(chǎn)生不需要的其他類型的組織或者影響患者健康的免疫反應(yīng)的風(fēng)險[30]。本研究結(jié)果證明，肝纖維化炎性因子能夠通過上調(diào)Smo和Gli1的表達激活MSCs的hedgehog通路，這可能會對MSCs功能以及特性產(chǎn)生一定的影響。有研究[31]發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓來源的MSCs移植能促進小鼠肝纖維化進程。此外，TNF-α和IFN-γ協(xié)同刺激MSCs，能通過NF-κB信號通路活化多個原癌基因，增加MSCs轉(zhuǎn)化為惡性細胞的敏感性[13]。這些體內(nèi)體外的實驗結(jié)果提示，MSCs在炎性因子的作用下可能會改變自身的特性，從而可能影響其對肝纖維化的療效。Kramann等[18]運用Cre-loxP遺傳譜系示蹤技術(shù)證明，在小鼠器官纖維化進程中，位于血管周圍的Gli1+細胞(間充質(zhì)干細胞樣的細胞)是肌成纖維細胞的主要起源細胞，證明器官纖維化的發(fā)生與血管周圍具有MSC特性的Gli1+細胞中的hedgehog-Gli1通路激活有關(guān)。這一結(jié)果也同樣證實，MSCs的hedgehog信號通路活化可能對于器官纖維化形成具有重要影響。因此，研究MSCs在肝纖維化炎癥微環(huán)境中的hedgehog通路的變化，對于提高MSCs移植治療的安全性具有重要的臨床意義。