釀酒酵母中表達(dá)神經(jīng)肉毒素A及其功能研究

NDIKUBWIMANA Jean de Dieu，邵侃凱，高曉冬，中西秀樹(shù)

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

基因組測(cè)序表明，在真核生物中，囊泡融合機(jī)制是高度保守的，SNARE蛋白是膜融合蛋白中的重要成員。SNARE蛋白是保守性很強(qiáng)的蛋白家族，經(jīng)常被分為 Q-SNARE蛋白和 R-SNARE蛋白[1]。SNARE蛋白位于特定的膜上，只有當(dāng)Q-SNARE蛋白 R-SNARE蛋白結(jié)合時(shí)，泡膜才能融合[1-2]。SNARE蛋白最初是從神經(jīng)元細(xì)胞中分離得到，在突觸囊泡融合中，syntaxin-1和 SNAP-25扮演 QSNARE角色，synaptobrevin則扮演著R-SNARE角色[1-2]。當(dāng)囊泡膜上的synaptobrevin與syntaxin-1和SNAP-25結(jié)合在一起時(shí)，突觸囊泡中的神經(jīng)遞質(zhì)就會(huì)釋放出來(lái)，傳遞給突觸末段。和突觸囊泡融合SNARE蛋白同源物類(lèi)似，在釀酒酵母細(xì)胞中，QSNARE蛋白Sso1/2和Sec9與R-SNARE蛋白Snc1/2結(jié)合在一起，形成一個(gè)平行的四螺旋復(fù)合體從而導(dǎo)致酵母細(xì)胞膜融合的進(jìn)行[2-3]。

肉毒神經(jīng)毒素（BotuIinum Neurotoxin，BoNT）是由厭氧梭狀肉毒芽胞桿菌屬生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的多分子復(fù)合物外毒素[4]，肉毒神經(jīng)毒素根據(jù)α-血清中和能力分為A-G7種亞型[5]，絕大部分脊椎動(dòng)物只要攝入微量即可引起肉毒中毒[6]。肉毒神經(jīng)毒素是目前已知毒性最強(qiáng)的神經(jīng)毒素，被美國(guó)疾病控制預(yù)防中心（CDC）列為A級(jí)生物恐怖劑[7]。肉毒神經(jīng)毒素是AB結(jié)構(gòu)的神經(jīng)毒素，由輕鏈（LC，～50 kDa）和重鏈（HC，～100 kDa）通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起組成[8]。輕鏈由一個(gè)鋅離子依賴的金屬蛋白酶區(qū)域組成，它可以降解 SNARE蛋白；肉毒神經(jīng)毒素類(lèi)型A，C，E可以降解 SNAP25，類(lèi)型 B，D，F(xiàn)，G 降解 VAMP-2，另外類(lèi)型C還可以降解Syntaxin 1a[9-13]。重鏈由兩個(gè)區(qū)域組成：一個(gè) N 端轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（HCT，～50 kDa）和一個(gè) C 端受體結(jié)合區(qū)域（HCR，～50 kDa）[14]。 HCR 進(jìn)一步分為HCRN和HCRC兩個(gè)更小的區(qū)域。HCRN沒(méi)有功能活性，但可能參與調(diào)整HCT最優(yōu)的幫助輕鏈進(jìn)入宿主細(xì)胞，而HCRC介導(dǎo)肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合到宿主受體[15-16]。Lacy和Stevens解決了肉毒神經(jīng)毒素A的晶體結(jié)構(gòu)[17]。

BoNT不僅僅是一種神經(jīng)毒素，它還可以作為一種治療藥物。早在1954年，Brooks發(fā)現(xiàn)在極度活躍的肌肉注射少量的BoNT/A會(huì)破壞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢乙酰膽堿的釋放，從而引起短暫的肌肉松弛[18]。這一發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了第1次使用BoNT/A作為治療藥物替代傳統(tǒng)手術(shù)治療人類(lèi)斜視[19]。這些開(kāi)創(chuàng)性的研究后，治療用BoNT/A擴(kuò)展到各種各樣由于功能失調(diào)的膽堿能終端引起的神經(jīng)障礙，例如痙攣性斜頸、眼瞼痙攣、面部癱瘓、肌張力障礙和痙攣狀態(tài)[20-21]。BoNT/A還用于美容治療和頭痛治療[22]。

雖然目前有不少關(guān)于BoNT/A的研究，但關(guān)于BoNT/A抗性藥物及其作為藥物用于醫(yī)用治療并不是十分成熟，而且沒(méi)有關(guān)于酵母肉毒中毒的研究。本研究在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)了BoNT/A輕鏈，在釀酒酵母中來(lái)研究BoNT/A輕鏈的功能及其能否降解Sec9蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母出發(fā)菌株Saccharomyces cerevisiaeYPH499，BoNT/A 表達(dá)用質(zhì)粒 pRS426-GAL1pr，SEC9表達(dá)用質(zhì)粒pRS414-TEFpr及引物相關(guān)信息見(jiàn)表1。SEC9基因由HXS 33和HXS 34引物PCR獲得，△Nsec9基因由HXO 573和HXS 34引物PCR獲得，BoNT/A基因由HXO 72和HXO 73引物PCR獲得，BoNT/AE224Q由 HXS 76和 HXS 77引物PCR獲得。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA T4連接酶及Ligation Mix連接酶購(gòu)于 TaKaRa公司 （大連）；KOD-Plus Neo DNA聚合酶購(gòu)于東洋紡公司（上海）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及脫脂奶粉購(gòu)于上海生工；ClarityTM Western ECL Substrate顯色劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；Mouse anti-HA一抗、Goat anti-mouse IGg-HRP二抗購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，v5抗體購(gòu)于近岸蛋白質(zhì)科技有限公司 （上海），PVDF膜購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司。無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇及異丙醇等其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

壓力蒸汽滅菌器（立式）購(gòu)于上海申安器械廠；電泳儀購(gòu)于北京六一儀器廠；pH計(jì)、電子天平購(gòu)于梅特勒-托利多儀器公司（上海）；無(wú)菌操作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于上海三發(fā)科學(xué)儀器公司；恒溫?fù)u瓶柜購(gòu)于江蘇太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)設(shè)備廠；PCR儀、移液槍購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó) Bio-Rad公司；半干電轉(zhuǎn)儀、SDS-PAGE凝膠電泳儀購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)公司；紫外分光光度計(jì)、ImageQuantTMLAS 400 mini購(gòu)置于美國(guó)GE公司；熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒和引物Table 1 Lists of strains，plasmids and primers used in this study

1.4 培養(yǎng)基及其他溶液配制

1）YPAD 培養(yǎng)基：酵母抽提物（Yeast Extract）20 g/L，蛋白胨（Peptone）10 g/L，腺嘌呤（Adeline）30 mg/L，瓊脂粉（Agar）20 g/L（固體培養(yǎng)基），葡萄糖20 g/L。 2）LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，氯化鈉（NaCl）10 g/L，瓊脂粉（Agar）20 g/L （固體培養(yǎng)基）；3）YNB 選擇培養(yǎng)基：YNB（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids）6.7 g/L，缺陷型粉末2 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L（固體培養(yǎng)基）。SG培養(yǎng)基是用半乳糖代替葡萄糖。4）8 mol/L 尿素：480.48 g 尿素，8.766 g NaCl，25 mmol/L（pH 8.0），加去離子水定容至 1 L。 5）TBST溶液：5 mol/L NaCl 30 ml，1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0）10 mL，Tween20 500 uL，加去離子水定容至 1 L。6）5%脫脂牛奶：稱取5g脫脂奶粉，用TBST定容至100mL。7）轉(zhuǎn)膜緩沖溶液：稱取甘氨酸 14.4 g，Tris·HCl 3.03g，量取無(wú)水甲醇200 mL，加去離子水定容至1 L。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)分析將質(zhì)粒pRS426-GALpr，pRS426-GALpr-BoNT/A轉(zhuǎn)化至YPH499細(xì)胞中，在SD尿嘧啶缺陷平板上篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在以葡萄糖為碳源的尿嘧啶缺陷培養(yǎng)平板劃線培養(yǎng)48 h，分別用牙簽挑取不同的轉(zhuǎn)化子在以葡萄糖和半乳糖為碳源的尿嘧啶缺陷平板上劃線，在30℃培養(yǎng)3 d，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.5.2 蛋白質(zhì)提取將不同細(xì)胞接種在5 mL以葡萄糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基中于 30℃培養(yǎng)至OD660=1.0，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 mL以葡萄糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基上于30℃培養(yǎng)至OD660=1.0，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移至30 mL以半乳糖為碳源的SD尿嘧啶培養(yǎng)基中，起始OD660=0.2，30℃培養(yǎng)至OD660=0.8～1.0。不同轉(zhuǎn)化子收集相同數(shù)量的細(xì)胞，用去離子水洗細(xì)胞1次，加8 mol/L尿素緩沖溶液和蛋白酶抑制劑PMSF，加玻璃珠震蕩破碎細(xì)胞，15 000 g，離心10 min取上清即為所提取蛋白。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.5.3 蛋白質(zhì)免疫印跡

1）電泳：取100 μg蛋白樣品上樣跑電泳，濃縮膠電壓 80 V，30 min，分離膠電壓 120 V，60 min。 2）轉(zhuǎn)膜：采用半干式轉(zhuǎn)膜方式，電壓25 V，電流1.0 A，時(shí)間30 min。3）封閉：5% 的脫脂奶粉封閉 1 h。4）孵育抗體：一抗 1∶5 000，室溫 1 h；二抗 1∶5 000 室溫 1 h。5）顯色：ECL顯色液A和B混勻，涂于膜上，用ImageQuant LAS4000mini顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 BoNT/A抑制釀酒酵母YPH499生長(zhǎng)

在人體內(nèi)，BoNT/A作用于神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)腔，特異性降解突觸體相關(guān)蛋白SNAP25抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而導(dǎo)致相關(guān)疾病，而酵母細(xì)胞中存在SNAP25的同源蛋白Sec9。盡管酵母是真核生物，是研究真核生物的模式生物，但是酵母細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞存在很大的差異，不知能否在酵母中檢測(cè)到BoNT/A的表達(dá)？在釀酒酵母YPH499細(xì)胞中表達(dá)BoNT/A是否會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)？如圖1所示，在釀酒酵母YPH499細(xì)胞中半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h之后可以檢測(cè)到表達(dá)的BoNT/A，表達(dá)BoNT/A會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，這種抑制作用可能是因?yàn)锽oNT/A過(guò)表達(dá)在酵母細(xì)胞中累積對(duì)細(xì)胞有毒害作用；也可能是因?yàn)檫^(guò)表達(dá)BoNT/A降解酵母細(xì)胞中膜融合所需要的SNARE蛋白或其他生長(zhǎng)必需蛋白。

圖1 BoNT/A抑制釀酒酵母YPH499生長(zhǎng)Fig.1 BoNT/A inhibits the growth of yeast

2.2 BoNT/A活性突變體不抑制釀酒酵母YPH499的生長(zhǎng)

為了研究在酵母細(xì)胞中BoNT/A的活性位點(diǎn)Glu224突變?yōu)镚ln后，突變的BoNT/A表達(dá)水平穩(wěn)定性有無(wú)影響，對(duì)酵母的生長(zhǎng)有無(wú)影響。如圖2所示，當(dāng)活性位點(diǎn)突變后，突變體BoNT/A表達(dá)水平穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有變化，并且不抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)。與本研究結(jié)果類(lèi)似，Kukreja等研究發(fā)現(xiàn)，BoNT/A的催化活性區(qū)域HEXXH的Glu224突變成Gln后，BoNT/A的催化活性完全失去[23]，這都說(shuō)明BoNT/A對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)抑制作用是通過(guò)其水解酶催化活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 BoNT/A活性突變體不抑制釀酒酵母YPH499生長(zhǎng)Fig.2 BoNT/A mutant does not inhibit the growth of yeast

2.3 在sec9△中過(guò)表達(dá)Sec9可以回補(bǔ)酵母的生長(zhǎng)

圖3 在sec9△中過(guò)表達(dá)Sec9可以回補(bǔ)酵母的生長(zhǎng)Fig.3 Overexpression of Sec9 in sec9△could rescue the yeast growth

由于SEC9是酵母生長(zhǎng)必須基因，在YPH499中敲除SEC9基因的酵母不能生長(zhǎng)，因此我們?cè)诮湍钢邢葘?dǎo)入一個(gè)pRS316-SEC9質(zhì)粒在敲除SEC9基因。如圖 3所示，sec9△（pRS316-SEC9）中導(dǎo)入pRS414TEF-SEC9質(zhì)粒，5-FOA移除pRS316-SEC9質(zhì)粒后 sec9△（pRS414TEF-SEC9）仍可以生長(zhǎng)，這說(shuō)明pRS414TEF-SEC9質(zhì)?？梢栽诮湍钢斜磉_(dá)并能回補(bǔ)sec9△菌株的生長(zhǎng)。

2.4 在酵母中過(guò)表達(dá)Sec9可以解除BoNT/A對(duì)生長(zhǎng)的抑制

從圖2可知，BoNT/A對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用是基于其水解酶蛋白活性。在動(dòng)物細(xì)胞中SNAP25是BoNT/A的降解底物，而在酵母中只有SNAP25的同源基因SEC9，因此，為了探究Sec9蛋白是否會(huì)被BoNT/A降解，本文在酵母中過(guò)表達(dá)Sec9蛋白，觀察是否能回補(bǔ)被BoNT/A抑制的酵母的生長(zhǎng)。如圖4所示，過(guò)表達(dá)Sec9可以回補(bǔ)被BoNT/A抑制的酵母的生長(zhǎng)。

圖4 過(guò)表達(dá)Sec9可以回補(bǔ)BoNT/A對(duì)釀酒酵母YPH499的抑制Fig.4 Overexpression of Sec9 could rescue the inhibition of BoNT/A to YPH499

3 結(jié)語(yǔ)

本研究在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)了BoNT/A，研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母細(xì)胞中BoNT/A通過(guò)其水解酶活性抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)活性位點(diǎn)被突變，失去水解酶活性的BoNT/A不會(huì)抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)?？梢岳媒湍讣?xì)胞研究BoNT/A的功能，同時(shí)還可以在酵母細(xì)胞中進(jìn)行BoNT/A抗性藥物的篩選。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)BoNT/A的釀酒酵母細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Sec9蛋白可以解除BoNT/A對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用?？梢酝茰y(cè)Sec蛋白可能是BoNT/A在酵母細(xì)胞中的識(shí)別底物，BoNT/A是通過(guò)降解Sec9蛋白從而抑制酵母的生長(zhǎng)。本研究為酵母中肉毒神經(jīng)毒素的研究提供了一定的理論依據(jù)，可以通過(guò)在酵母中表達(dá)肉毒神經(jīng)毒素，可以對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)一步研究，可以在酵母中建立肉毒神經(jīng)毒素篩選系統(tǒng)，還可以探索在酵母中是否存在肉毒神經(jīng)毒素新的降解底物。