代謝工程改造釀酒酵母生產(chǎn)L-蘋果酸

陳修來 ，王元彩 ，董曉翔 ，羅秋玲 ，劉 佳 ，劉立明 *

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

L-蘋果酸作為生物體TCA循環(huán)的重要中間體，在食品、化工、醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用[1]。早期關于L-蘋果酸的研究主要集中于高產(chǎn)菌株的篩選和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[1-2]。通過優(yōu)化發(fā)酵條件，如：轉速、溶氧、氮源濃度、金屬離子及CaCO3添加量等，使得黃曲霉（Aspergillus flavus）在 190 h時能夠積累113 g/L的L-蘋果酸，生產(chǎn)強度達到0.59 g/L/h[1]。由于高產(chǎn)L-蘋果酸的野生型菌株為霉菌[3]，具有發(fā)酵周期長、條件難以控制、產(chǎn)生黃曲霉毒素等缺點，使其不能被廣泛的應用[4]。因此，近年來的研究主要集中于代謝工程策略改造常見工業(yè)微生物生產(chǎn)L-蘋果酸，如：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）[5]、光滑球擬酵母 （Torulopsis glabrata）[6]和大腸桿菌（Escherichia coli）[7-8]等。 由于S.cerevisiae較其他微生物，具有以下優(yōu)點：（1）良好的食品安全性，S.cerevisiae已廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域；（2）低pH耐受性，有利于高效積累有機酸、降低下游提取純化成本；（3）高葡萄糖耐受性，為實現(xiàn)高密度發(fā)酵奠定基礎。因此，S.cerevisiae被認為是二羧酸生產(chǎn)的潛在高效細胞工廠[9]。

目前，S.cerevisiae生產(chǎn)L-蘋果酸的代謝策略主要有：1）L-蘋果酸積累路徑的構建：以丙酮酸為起點在丙酮酸羧化酶 （PYC）及蘋果酸脫氫酶（MDH）的作用下積累L-蘋果酸，即胞質(zhì)還原路徑，因該路徑簡單且理論得率高，而被廣泛應用于二羧酸的生產(chǎn)[7-10]。通過在丙酮酸高產(chǎn)菌株S.cerevisiaeTAM中過量表達基因PYC2和MDH△SKL構建L-蘋果酸積累的胞質(zhì)還原路徑，使得L-蘋果酸產(chǎn)量提高了3倍[11]；2）轉運系統(tǒng)的強化：研究表明L-蘋果酸的外轉運是限制L-蘋果酸積累的關鍵性因素[6，12]。在構建完成L-蘋果酸路徑的基礎上，過量表達源于栗酒裂殖酵母 （Schizosaccharomyces pombe）的C4-二羧酸轉運蛋白，使得L-蘋果酸產(chǎn)量提升到了31.5 g/L[5]；3）啟動子表達水平的改造：Pines等[13]利用不同表達強度的啟動子，對基因MDH2進行過量表達，有效的提高了MDH的酶活，最終使得L-蘋果酸產(chǎn)量達到11.8 g/L。

本研究以高產(chǎn)丙酮酸的S.cerevisiaetTAM為出發(fā)菌株，利用分子生物學手段將高產(chǎn)L-蘋果酸A.flavus代謝路徑表達于S.cerevisiae中，構建Afpyc單表達，Afpyc、Afmdh雙基因共表達和Afpyc、Afmdh、Afmae三基因共表達的工程菌株，通過分析基因表達對碳流分布的影響，探討A.flavus胞質(zhì)還原路徑對S.cerevisiae積累L-蘋果酸的影響，為利用代謝工程策略生產(chǎn)L-蘋果酸提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒S.cerevisiaeTAM由荷蘭代爾夫特理工大學Jack T.Pronk教授贈送。pY26和pY14購自Turbo生物工程有限公司。pMD19-T-simple購自TaKaRa（大連）生物工程有限公司。表1為本研究所用的菌株和質(zhì)粒。

1.1.2 主要儀器和試劑紫外可見分光光度計（日本島津公司，型號UV2450）；SBA生物傳感儀（山東科學院生物研究所）；高效液相色譜儀（美國賽默爾飛，型號Ultimate 3000）。丙酮酸和L-蘋果酸標準品購自sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 引物本研究所用引物如表2所示，引物GMC-SacI-S、GMC-NotI-A為擴增GPD啟動子、多 克 隆 位 點 、CYC1 引 物 ；18SrDNA-BglII-S、18SrDNA-SphI-A為擴增18S rDNA引物；rDNAtrp-SacINotI-S、rDNAtrp-NcoI-A 為擴增Trp引物。Afpyc-BamH I-S和Afpyc-PstI-A用于擴增基因Afpyc；Afmdh-NotI-S和Afmdh-BglII-A用于擴增基因Afmdh；Afmae-EcoR I-S和Afmae-XhoI-A用于擴增基因Afmae。

1.1.4 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉 10，酵母膏5，蛋白胨 10。YNB培養(yǎng)基 （g/L）：葡萄糖20，YNB 6.7，根據(jù)需要添加20 mg/L的氨基酸。種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，YNB 6.7，碳酸鈣 5。發(fā)酵培養(yǎng)基 （g/L）： 葡萄糖 80，K2SO46.6，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.5，尿素終濃度1，生物素終濃度為10-3，CaCl2·2H2O終濃度為0.735，碳酸鈣 25（接種時添加5 g/L，發(fā)酵48 h時添加20 g/L），微量金屬離子液、維生素液均為1 mL/L。微量金屬離子液（mg/L）：EDTA 15，ZnSO4·7H2O 4.5，CoCl2·6H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1，CuSO4·5H2O 0.3，CaCl2·2H2O 4.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 3，NaMoO4·2H2O 0.4，H3BO31，KI 0.1。 維生素液（mg/L）：生物素 0.05，泛酸鈣 1，煙酸 1，肌醇 25，鹽酸硫胺素1，鹽酸吡哆醇1，對氨基苯甲酸0.2。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 分子生物學操作

1.2.1 RNA的提取及18S rDNA整合表達框的構建利用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒 （上海生工生物），提取總A.flavus的 RNA。按照PrimerScript RT reagent Kit Perfect Real Time試劑盒（TaKaRa），將RNA反轉錄獲得cDNA。以cDNA為模板，利用引物Afpyc-BamH I-S和Afpyc-PstIA進行PCR擴增獲得Afpyc基因?；诖?，設計Afpyc基因18S rDNA整合表達框的構建流程 （圖1）：（1） 利用引物 GMC-SacI-S、GMC-NotI-A 為擴增GPD啟動子的表達元件，并將其連接于pMD19-T-simple載體，獲得pMD19-GMC；（2）利用引物18SrDNA-BglII-S與 18SrDNA-SphI-A、rDNAtrp-SacINotI-S與rDNAtrp-NcoI-A進行PCR擴增，分別獲得18SrDNA基因片段、Trp標記基因，并將其連接至pMD19-T-simple載體，獲得pMD19-18S-TRP；（3）將Afpyc基因插入到 pMD19-GMC的GPD啟動子的表達元件中，獲得pMD19-GMCAfpyc；（4） 將 pMD19-18S-TRP 的 18S-TRP 片段，通過酶切與連接的方法，連接到pMD19-GMCAfpyc，獲得Afpyc基因的融合表達載體pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP。

圖1 基因Afpyc的18S rDNA整合表達框構建Fig.1 Construction procedure of gene Afpyc intergration plasmid pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP

1.2.2 重組質(zhì)粒的構建以A.flavusATCC13697的 cDNA為模板，擴增關鍵基因Afpyc、Afmdh、Afmae。利用限制性酶BamH I&PstI、NotI&BglII雙酶切后，借助T4連接酶分別連接至pY14、pY26， 獲得重組質(zhì)粒 pY14/Afpyc、pY26/TEFAfmdh。在此基礎上，利用限制性酶EcoR I&XhoI雙酶切后，借助T4連接酶連接至pY26/TEFAfmdh，獲得重組質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh-GPDAfmae。

1.3 蘋果酸發(fā)酵條件及參數(shù)測定

1.3.1 培養(yǎng)條件將平板菌落接種于種子培養(yǎng)基，30℃，200 r/min培養(yǎng) 48 h，4 000 r/min離心 5 min收集菌體。將菌體以發(fā)酵培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整發(fā)酵起始OD600為1.0，30℃，200 r/min培養(yǎng)96 h。 發(fā)酵起始時，添加5 g/L的CaCO3；當發(fā)酵48 h時，補充20 g/L 的 CaCO3。

1.3.2 發(fā)酵參數(shù)測定葡萄糖的測定：利用SBA-40E生物傳感分析儀測定，發(fā)酵液經(jīng)適當?shù)南♂尯?，?5 μL直接進樣到生物傳感器中，根據(jù)葡萄糖標準樣品濃度、儀器讀書及發(fā)酵液稀釋倍數(shù)計算發(fā)酵液中的葡萄糖含量。

菌體干重測定：將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后，以相應的培養(yǎng)基作為對照，在波長600 nm處測定吸光值，并將該吸光值按照細胞干重 （Dry Cell Weight，DCW）與菌體吸光值的線性曲線（1 OD600=0.23 g/L DCW），計算菌體干重。

有機酸測定：采用高效液相色譜（HPLC）測定，色譜柱為 Atlantis?C18（5 μm 4.6×250 mm），流動相為 0.1 mol/L KH2PO4，pH 2.8；流速為 0.6 mL/min；柱溫為20℃；進樣量為20 μL；檢測器為紫外檢測器；檢測波長為210 nm。胞內(nèi)蘋果酸的提取及樣品預處理方法參照文獻[14-15]。

甘油測定：采用HPLC測定，色譜柱為BioRad Aminex HPX-87H，流動相為5 mmol/L稀硫酸；柱溫為 35℃；流速為 0.6 mL/min；進樣量為 20 μL；檢測器為示差檢測器。

1.3.3 酶活測定取不同時期的發(fā)酵液離心棄上清，用0.1 mol/L、pH 8.0的磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，并懸浮于緩沖液中，超聲破碎10 min（工作5 s，間隔 5 s）后，4 ℃，8 000 r/min 離心 3 min，所得上清液用于酶活測定。蘋果酸脫氫酶的酶活測方法定參考文獻[5]。丙酮酸羧化酶的酶活測定參考文獻[16]。蛋白質(zhì)濃度的測定，采用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（上海生工生物）。

2 結果與分析

2.1 Afpyc的表達對碳流分布的影響

丙酮酸羧化酶是影響蘋果酸、富馬酸等二羧酸大量積累的關鍵因素[5，10]，且其低水平表達有利于提高目標產(chǎn)物[10-17]。前期研究表明，Afpyc基因的中、高水平表達對菌體生長有一定的抑制作用。因此，考察了Afpyc低水平表達對碳流分布的影響。將整合表達質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP，利用限制性內(nèi)切酶SphI和BglII進行雙酶切，得到條帶大小分別為6 165 bp和2 692 bp的片段（圖2），表明該整合表達質(zhì)粒已經(jīng)構建成功。將測序正確的Afpyc基因 （3 582 bp）經(jīng)BamH I、PstI雙酶切后，連接用相同限制酶酶切的表達載體pY14，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為5 414 bp和3 582 bp的片段，表明質(zhì)粒pY14/Afpyc已經(jīng)構建成功。利用LiAc轉化法，將線性化的質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18STRP和重組質(zhì)粒pY14/Afpyc分別轉入菌株tTAM中，篩選獲得陽性轉化子，并分別命名為W002和W003（表 1）。

基因Afpyc的單獨表達能夠調(diào)節(jié)碳流分布，降低丙酮酸的積累量，具體表現(xiàn)在 （表3）：1）菌株W002和W003的丙酮酸羧化酶比酶活分別為0.63 U/mg和0.78 U/mg，相對于對照組W001分別提高了30倍和38倍，且單獨表達Afpyc基因，對菌體生長沒有影響；2）菌株W002、W003的丙酮酸積累量相對于W001分別降低了29.6%和42.3%；3）分析其他副產(chǎn)物情況可知，菌株W002、W003的α-酮戊二酸 （α-KG）積累量較對照組W001分別提高了48.1%和79.7%，這可能是由于Afpyc基因的表達使得丙酮酸的碳流流向草酰乙酸，從而進入TCA循環(huán)，導致部分α-酮戊二酸（α-KG）積累[18]。上述結果表明Afpyc的低水平表達能夠有效的調(diào)節(jié)丙酮酸節(jié)點的碳流分布，且Afpyc基因的低水平游離表達效果較好。因此，選擇菌株W003進行下一步研究。

2.2 Afmdh的表達對碳流分布的影響

為了進一步將碳流導向L-蘋果酸，將測序正確的Afmdh基因經(jīng)NotI、BglII雙酶切后，連接至相同限制酶酶切的表達載體pY26，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為7 430 bp和996 bp的片段 （圖3（a）），表明重組質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh構建成功。利用LiAc轉化法，將上述質(zhì)粒轉入菌株W003，獲得菌株W005。

圖2 質(zhì)粒pMD19-GMC-Afpyc-18S-TRP、pY14/Afpyc酶切驗證Fig.2 Confirmation of recombinant plasmid pMD19-GMC-Afpyc、pY14/Afpyc

將菌株W005經(jīng)搖瓶發(fā)酵后，研究基因Afmdh的表達對碳流分布的影響，結果如圖3所示：1）菌株W005的蘋果酸脫氫酶比酶活為0.63 U/mg，細胞干重DCW為1.54 g/L，比對照組W004分別提高了350.2%和23.3%；2）發(fā)酵96 h時，菌株W005積累了1.93 g/L的L-蘋果酸，但是，其胞內(nèi)L-蘋果酸濃度達到了7.52 mg/g DCW，比對照組菌株W004提高了1.59倍；3）菌株W005的丙酮酸產(chǎn)量為9.03 g/L，相對于菌株W004降低了62.5%。上述結果表明，基因Afmdh的表達有利于菌體生長，且共表達基因Afpyc和Afmdh能夠進一步將丙酮酸的碳流導向L-蘋果酸。但是由于菌株W005的胞內(nèi)L-蘋果酸濃度較高，限制了L-蘋果酸的進一步積累。目前，已有研究表明，蘋果酸的外轉運是限制L-蘋果酸大量積累的一個關鍵性因素[5-6，12]，因此，需要強化L-蘋果酸的外運系統(tǒng)，降低胞內(nèi)L-蘋果酸的積累量，進一步提高L-蘋果酸產(chǎn)量。

表3 Afpyc的表達對碳流分布的影響Table 3 Fermentation profiles by overexpressing Afpyc

2.3 Afmae的表達對L-蘋果酸積累的影響

圖3 胞質(zhì)還原路徑對L-蘋果酸積累的影響Fig.3 Effect of construct rTCA pathway on the production of L-malate

通過在菌株W005中過表達基因Afmae，強化L-蘋果酸的外轉運系統(tǒng)，促進胞內(nèi)L-蘋果酸向胞外轉運。將測序正確的Afmae基因經(jīng)EcoR I、XhoI雙酶切后，連接至相同限制酶酶切的表達載體pY26/TEF-Afmdh，經(jīng)雙酶切獲得條帶大小分別為8 443 bp 和 996 bp 的片段（圖 4（a）），表明重組質(zhì)粒 pY26/TEF-Afmdh-GPD-Afmae構建成功。利用LiAc轉化法，將上述質(zhì)粒轉入菌株W003，獲得菌株W006。

在此基礎上，分析基因Afmae的表達對菌株W006積累L-蘋果酸的影響，結果表明：（1）發(fā)酵96 h時，菌株W006的L-蘋果酸積累量為2.34 g/L，相對于 W005提高了 21.2%；（2）菌株 W006的DCW由1.54 g/L提高到1.88 g/L，提高了22.1%；（3）分析其他副產(chǎn)物情況可知，丙酮酸積累量為10.4 g/L，沒有進一步下降（圖 4（b）），且仍然存在少量的α-酮戊二酸（α-KG）和甘油。上述結果表明，外轉運系統(tǒng)的強化有利于菌體生長及L-蘋果酸的積累。

圖4 質(zhì)粒pY26/TEF-Afmdh GPD-Afmae的驗證及菌株W006發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸Fig.4 Vertification of plasmid pY26/TEF-Afmdh GPD-Afmae and fermentation performance of strain W006

2.4 接種量對L-蘋果酸積累的影響

為了進一步提高L-蘋果酸產(chǎn)量，研究了不同接種量對L-蘋果酸積累的影響，結果如表4所示：1）初始接種量OD600=2時，L-蘋果酸的產(chǎn)量最高達到3.28 g/L，最終菌體DCW為2.34 g/L，單位細胞產(chǎn)L-蘋果酸能力（L-malate/DCW）為1.40 g/L/gDCW，較對照組 （OD600=1）分別提高了40.2%、13.0%和22.8%；2）當初始接種量OD600＜2時，隨著接種量的增加，菌體DCW、L-蘋果酸產(chǎn)量和L-malate/DCW也隨之提高；3）當初始接種量OD600＞2時，菌體DCW和L-蘋果酸產(chǎn)量開始下降。上述結果表明，L-蘋果酸產(chǎn)量提高的原因，一方面是由于菌體DCW的增加，另一方面是由于單位菌體生產(chǎn)能力 （L-malate/DCW）的提高。因此，后續(xù)研究可以通過濃縮菌體量的方式，進一步提高L-蘋果酸的產(chǎn)量。

表4 接種量對L-蘋果酸發(fā)酵的影響Table 4 Effect of initial inoculum on the production of L-malic acid

3 討 論

丙酮酸生產(chǎn)菌S.cerevisiaeTAM能夠積累高濃度的丙酮酸，這為構建理性的L-蘋果酸生物合成路徑，有效地將丙酮酸碳流導向L-蘋果酸奠定了基礎[5]。本研究構建的L-蘋果酸生物合成路徑涉及2個關鍵酶：丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶，該路徑在理論上能夠?qū)崿F(xiàn)L-蘋果酸的最大化生產(chǎn)。已有研究表明，丙酮酸羧化酶是高效生產(chǎn)氨基酸和四碳二羧酸的主要代謝瓶頸，因此，該酶也是進行基因改造獲取高產(chǎn)菌株的重要靶標酶[19-21]。過量表達丙酮酸羧化酶能夠有效增強自丙酮酸到草酰乙酸的碳流，從而，一方面增加L-蘋果酸合成的直接前體，另一方面提高進入TCA循環(huán)的碳流[22]。然而，提高的碳流最終并沒有轉變成更多的L-蘋果酸，其原因可能是蘋果酸合成路徑的下游草酰乙酸代謝路徑存在著限速步驟[5]。單獨過量表達蘋果酸脫氫酶，使得由草酰乙酸到L-蘋果酸的產(chǎn)物代謝流得到了很大的提升[23]。但是，蘋果酸脫氫酶的過量表達大量消耗了胞質(zhì)的NADH，有效地增強了糖酵解的速率[24-25]。綜上所述，結合丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶的特點，本研究通過過量表達丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶將碳流由丙酮酸導向L-蘋果酸，成功構建了L-蘋果酸積累的胞質(zhì)還原路徑。

然而，上述路徑并不能有效的將丙酮酸碳流導向L-蘋果酸，原因在于L-蘋果酸生物合成路徑中存在著動力學代謝瓶頸。本研究中，通過測定胞內(nèi)L-蘋果酸的含量，發(fā)現(xiàn)菌株W005胞內(nèi)L-蘋果酸濃度達到了7.52 mg/g DCW，比對照組菌株W004提高了1.59倍。上述結果初步證明了L-蘋果酸的外轉運能力弱為關鍵代謝瓶頸。因此，應當增強工程菌W005對二羧酸的轉運能力以便于競爭性轉運胞質(zhì)中的L-蘋果酸，提高發(fā)酵液中L-蘋果酸的積累量。已有研究表明，通過過量表達SpMAE1能夠有效地將胞質(zhì)中的L-蘋果酸轉運到胞外，使得在發(fā)酵液中積累更多的L-蘋果酸[26]。基于此，為了進一步提高L-蘋果酸的產(chǎn)量，將SpMAE1過量表達于W005中（即W006），最終使得L-蘋果酸的產(chǎn)量比W005提高了21.2%。

然而，工程菌W006除了產(chǎn)生L-蘋果酸外，仍然能夠產(chǎn)生13.94 g/L丙酮酸，及少量的α-酮戊二酸等雜酸，從而大大提高了L-蘋果酸的下游提取成本，該結果表明，L-蘋果酸的生產(chǎn)菌株仍有再次提高的空間。伴隨著組學技術的發(fā)展，系統(tǒng)代謝工程作為一種概念性技術框架，有效地加速了對存在路徑的修飾，有效地優(yōu)化了對目標代謝物的生產(chǎn)，為高效改造微生物生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品提供了新的方法[27]。例如，利用轉錄組、蛋白組和代謝組能夠有效深入的分析利用還原路徑生產(chǎn)L-蘋果酸所存在的代謝瓶頸。在上述基礎上，利用模塊路徑工程系統(tǒng)性的裝配與優(yōu)化代謝模塊，進而精細化控制已經(jīng)存在的代謝路徑，實現(xiàn)生產(chǎn)宿主的代謝平衡，進而有效地消除代謝瓶頸，改善微生物的細胞表型[28]。最終，實現(xiàn)雜酸大幅度降低、L-蘋果酸大幅度提高，從而有效的降低L-蘋果酸的下游提取成本。

4 結 語

通過在S.cerevisiae中過量表達源于A.flavus的丙酮酸羧化酶（Afpyc）、蘋果酸脫氫酶（Afmdh）及C4-二羧酸轉運蛋白（Afmae），成功構建了L-蘋果酸合成的胞質(zhì)還原路徑。在此基礎上，通過優(yōu)化工程菌株W006的發(fā)酵條件，使得L-蘋果酸的積累量達到3.28 g/L。本研究為利用異源路徑生產(chǎn)L-蘋果酸提供了一種新的借鑒。