絲素接枝含酪氨酸多肽對其酶促改性的影響

朱雪珂，周步光，王 平，崔 莉，季 吉，王 強(qiáng)，范雪榮

（江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

京尼平（Genipin，GP）是梔子苷經(jīng) β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，是傳統(tǒng)中藥杜仲的活性成分之一，是從京尼平苷中分離、提純而獲得的。京尼平屬于環(huán)烯醚萜類化合物，作為優(yōu)良的天然交聯(lián)劑，可以與含游離氨基的高分子（如蛋白質(zhì)、膠原和殼聚糖等）交聯(lián)構(gòu)建生物材料[1-3]。絲素（SF）是一類天然蛋白類高分子，具有良好的機(jī)械性能、生物相容性和低免疫原性，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域得到應(yīng)用。絲素蛋白由20多種氨基酸組成，盡管其中含酚羥基的酪氨酸殘基量接近10%，但由于其包埋在由甘氨酸和丙氨酸組成的疏水鏈中，在酪氨酸酶催化絲素改性中酪氨酸殘基可及度較低，從而影響了絲素酶促改性效率[4-5]。為提高絲素的反應(yīng)性，可在其表面接枝含酪氨酸的多肽[6-7]，其中定制多肽GKGYGGYGK中酪氨酸的含量約為40%，賴氨酸含量約為32%。若借助于生物或化學(xué)方法將該多肽接枝到絲素蛋白上，通過提高絲素蛋白上酪氨酸殘基的含量，則可提升酪氨酸酶催化絲素接枝伯胺類分子的效率，利于改善絲素蛋白膜的性能。

本文作者借助于生物交聯(lián)劑京尼平，促使含酪氨酸的多肽在絲素蛋白表面接枝，分析多肽在絲素表面接枝效果及交聯(lián)機(jī)制，探究其對酪氨酸酶催化絲素蛋白接枝聚賴氨酸效果的影響，拓展基于酪氨酸酶法的酶促絲素蛋白改性效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

桑蠶絲織物（90 g/m2）；京尼平（GP，上海寶曼生物技術(shù)有限公司）；多肽（P，序列為GKGYGGYGK，鄭州派和泰德醫(yī)藥科技有限公司）；酪氨酸酶（TYR，1070 U/mg， 美 國 Worthington Biochemical Corporation）；ε-聚賴氨酸（ε-PL，鄭州拜納福生物工程股份有限公司）；無水氯化鈣、無水乙醇、冰醋酸、醋酸鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

UV-1800紫外可見分光光度計（SHIMADZU，日本）；高效液相色譜儀（Waters e2695，美國Waters公司）；KDII-0.05微機(jī)控制萬能強(qiáng)力試驗機(jī) （深圳市凱強(qiáng)利實驗儀器有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備將脫膠后桑蠶絲織物以氯化鈣-乙醇體系 （摩爾比CaCl2∶CH3CH2OH∶H2O=1∶2∶8）溶解，在 70±2 ℃的水浴鍋中攪拌 3 h 后冷卻至室溫，透析3 d去除鹽組分，經(jīng)離心去除雜質(zhì)后得到絲素蛋白溶液。

1.2.2 京尼平交聯(lián)絲素蛋白和多肽以京尼平（4 g/L）在 37℃、pH 6.0條件下處理多肽（1.5 mmol/L）和絲素蛋白溶液（20 g/L），處理時間7 h；對照樣不加京尼平或多肽。

1.2.3 絲素蛋白膜的制備將1.2.2節(jié)中的反應(yīng)液倒入聚四氟乙烯模具中，在-20℃下冷凍5 h，再在-50℃的冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，制得絲素凍干膜；或?qū)⒎磻?yīng)液在室溫條件下風(fēng)干，制備絲素風(fēng)干膜。

1.3 測試方法

1.3.1 UV-Vis光譜分析以UV-1800紫外/可見分光光度計測定絲素溶液反應(yīng)體系的吸光度，記錄溶液在400～800 nm范圍內(nèi)溶液吸光度的變化。

1.3.2 SDS-PAGE凝膠電泳取 20 μL樣品與 5 μL上樣緩沖液（5×）混合均勻，在100℃水浴中沸煮10 min，取5 μL混合液上樣到8%～16%梯度膠上，然后在蛋白質(zhì)凝膠電泳儀上進(jìn)行實驗，濃縮膠階段電壓100 V，分離膠階段電壓為200 V。電泳結(jié)束后，以考馬斯亮藍(lán)R-250染色，最后進(jìn)行脫色。

1.3.3 體積排阻色譜（SEC）不同條件下處理樣品經(jīng)離心和過濾后，借助高效液相色譜儀考察其分子量分布變化，實驗條件：BioSuite450凝膠色譜柱（7.8 mm ×300 mm，8 μm）、2414 RI Detector、2998 PDA Detector，流量 0.5 mL/min，流動相為 PBS（0.05 mol/L pH=7 磷酸鹽緩沖溶液，0.3 mol/L NaCl）。

1.3.4 紅外分析采用FTIR光譜儀的ATR模式，在波長范圍為4 000～650 cm-1內(nèi)對不同的冷凍干燥膜樣品進(jìn)行紅外光譜分析。掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。

1.3.5 熱重法-微商熱重法 （TG-DTG）使用熱重分析儀分別測定處理后的絲素膜的TG-DTG。條件為：樣品量約為2 mg，升溫速度：10℃/min，升溫范圍：30～500 ℃，N2氣氛（高純 N2，流量為 40 mL/min）。

1.3.6 機(jī)械性能的測定使用萬能材料試驗機(jī)對絲素風(fēng)干膜進(jìn)行機(jī)械性能測試，拉伸速度為40 mm/min，夾距為40mm。測試前樣品裁剪成80 mm×5 mm樣條，并放在恒溫恒濕箱（20℃，RH=65%）中平衡24 h，實驗中每個樣品進(jìn)行10次重復(fù)試驗，樣品斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率分別如下。

1.3.7 絲素膜表面ε-PL接枝率測定溶液中ε-PL濃度測定采用Itzhaki比色法[8]。實驗中制作ε-PL與甲基橙吸光度的相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中當(dāng)ε-PL的質(zhì)量濃度在0～0.1g/L時，其濃度與吸光度A465具有良好的線性關(guān)系為

式中：C為ε-PLL的濃度；A為溶液在465 nm處的吸光值。

酶促絲素膜表面接枝ε-PL中，通過分光法測定吸光度，借助于標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ε-PL的接枝率。

2 結(jié)果與討論

2.1 京尼平對絲素/多肽體系吸光度的影響

含酪氨酸的多肽分子鏈上含3個游離氨基，絲素蛋白分子端基及賴氨酸殘基中也含有一定量的氨基，GP可與多肽和絲素蛋白分子中的氨基反應(yīng)，從而形成梔子藍(lán)色素，使反應(yīng)體系呈藍(lán)色，借助于分光法可了解絲素蛋白的交聯(lián)效果[9-10]。

利用紫外可見光光譜掃描，檢測SF/GP/P體系溶液吸收光譜變化，其中京尼平和氨基酸反應(yīng)后生成的梔子藍(lán)色素的特征吸收峰在600 nm附近。圖1中對照樣1、2、3和4溶液均無色，而樣品5和6呈藍(lán)色；圖2中在600 nm附近出現(xiàn)新的特征吸收峰，與溶液中呈現(xiàn)藍(lán)色相吻合，表明GP的交聯(lián)作用使得SF+GP和SF+GP+P中均有梔子藍(lán)色素出現(xiàn)。

圖1 京尼平反應(yīng)后絲素/多肽體系溶液的色外觀Fig.1 Appearances of fibroin/polypeptide solutions after treated by GP

2.2 京尼平對絲素/多肽體系分子量分布的影響

京尼平可與氨基化合物上的游離氨基反應(yīng)，或經(jīng)過自身聚合后再與外源氨基化合物反應(yīng)，形成分子內(nèi)或分子間的共價鍵[11-12]。實驗中借助于SDSPAGE、HPLC[13-14]評價京尼平對絲素蛋白分子量的影響，結(jié)果如圖3和4所示。

圖2 京尼平處理絲素/多肽體系的紫外可見吸收光譜Fig.2 Absorbancesofsilk fibroin and polypeptide solution after GP treatment

圖3 京尼平交聯(lián)后絲素溶液SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGEs of fibroin and polypeptide after crosslinking with GP

GP和P的分子量較?。ǚ謩e為226和885），圖3中對應(yīng)的泳道1和2沒有明顯譜帶；絲素蛋白分子量在幾萬到幾十萬的范圍內(nèi)，泳道3沒有明顯的分子量集中分布譜帶；泳道4和泳道3的顏色深淺差別不大，說明在僅絲素蛋白和P存在時，兩者間未發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)；泳道5比泳道3的顏色要深一些，說明在GP作用下，絲素蛋白發(fā)生了自交聯(lián)；泳道6比泳道3和5的譜帶顏色都深，表明絲素蛋白在GP的作用下除了發(fā)生自交聯(lián)作用外，還存在P接枝到絲素蛋白上，同時P還可能作為橋梁連接絲素蛋白分子，使得溶液中蛋白分子量整體增加。為進(jìn)一步驗證GP促進(jìn)P接枝絲素蛋白的效果，采用尺寸排阻色譜（Size Exclusion Chromatography,SEC）凝膠柱檢測絲素蛋白分子量變化，結(jié)果見圖4。

圖4 京尼平交聯(lián)絲素蛋白的體積排阻色譜Fig.4 SEC chromatograms of fibroin and polypeptide after incubating with GP

圖4 中可以看出，GP（曲線1）和絲素SF（曲線3）最高峰值相應(yīng)的保留時間分別為24.8 min和27.9 min，P（曲線2）最高峰對應(yīng)的保留時間約為27 min；GP+SF（曲線 4）比 SF（曲線 3）的出峰時間略有縮短，這是由于GP使SF分子間發(fā)生了交聯(lián)；GP+SF+P（曲線5）的出峰時間比GP+SF（曲線4）有所提前，是因為更多絲素分子間通過P發(fā)生交聯(lián)。圖3和圖4結(jié)果表明，GP可引發(fā)絲素蛋白和多肽發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，導(dǎo)致絲素分子量整體增加，這與圖1溶液色外觀變化、圖2的吸光度結(jié)果一致。

2.3 京尼平對絲素/多肽結(jié)構(gòu)及結(jié)晶度的影響

交聯(lián)絲素蛋白和多肽的之后，京尼平分子中六元環(huán)上的氧原子會被伯氨基的N取代，形成含叔胺N的雜環(huán)[1]，因此可以通過進(jìn)行紅外光譜分析考察其結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果見圖4和5。

圖5 京尼平紅外吸收光譜Fig.5 FTIR spectra of GP

由圖5可得，京尼平有一些明顯特征峰。1 684 cm-1附近的吸收峰為C=O的伸縮振動；1 621 cm-1強(qiáng)吸收峰為烯環(huán)上C=C的伸縮振動；1 153 cm-1和1 111 cm-1處的吸收峰是C-O的伸縮振動；881 cm-1附近的吸收峰，被認(rèn)為是雜環(huán)上的C-H的伸縮振動區(qū)。京尼平為雜環(huán)化合物，含有多個活性基團(tuán)，可與氨基反應(yīng)生成深藍(lán)色素，從而起到交聯(lián)效果[1]。

圖6中絲素蛋白在酰胺 I、酰胺 II、酰胺III的峰分別出現(xiàn)在1 641、1 520、1 234 cm-1附近。在1 108 cm-1與887 cm-1波長處出現(xiàn)了新的吸收峰，其中1 108 cm-1代表了C-N伸縮振動，且此N原子是與氨基反應(yīng)后形成的叔胺N原子，887 cm-1處的特征峰為雜環(huán)上C-H伸縮振動，證明了京尼平和絲素或多肽中的-NH2發(fā)生了交聯(lián)作用。曲線d中1 108 cm-1與887 cm-1波長處出現(xiàn)的峰的強(qiáng)度均比曲線c中的高，說明SF+GP+P樣品中有更多C-N和C-H，驗證了絲素蛋白和多肽間發(fā)生交聯(lián)?？疾旖z素蛋白接枝多肽膜材料的熱學(xué)性能，結(jié)果見圖7。

圖6 絲素/多肽凍干膜的ATR-FTIR光譜圖Fig.6 FTIR spectras of the freeze-dried membranes of fibroin/polypeptide

圖7 中改性絲素和空白樣的曲線變化情況基本一致，均有兩階段的質(zhì)量損失。其中，第1階段的質(zhì)量損失出現(xiàn)在30～200℃范圍內(nèi)，是因為絲素膜表面或內(nèi)部自由水蒸發(fā)引起；第2階段在200～500℃，最大分解速率在290℃附近，主要是由大分子熔融降解引起的。SF和SF+P樣品的失重溫度分別為291.52℃和294.52℃，經(jīng)GP交聯(lián)之后，SF+GP和SF+GP+P樣品的失重溫度有所上升，分別是303.14℃和299.28℃，表明交聯(lián)后的絲素樣品熱穩(wěn)定性提高。加入交聯(lián)劑后，交聯(lián)劑分子在相鄰大分子間有結(jié)合力，結(jié)合力使大分子相互靠攏，分子鏈間作用力增加，排列規(guī)整化，使得絲素膜結(jié)晶度有所增加，其穩(wěn)定性也相應(yīng)增加[13]。SF+GP+P樣品失重溫度比SF+GP略低，可能是由于部分絲素分子和多肽發(fā)生交聯(lián)，使絲素蛋白自身間交聯(lián)有所減少所致。

圖7 絲素/多肽凍干膜TG/DTG曲線Fig.7 TGA and DTG curves of the freeze-dried membranes of fibroin/polypeptide

2.4 京尼平對絲素/多肽風(fēng)干膜機(jī)械性能的影響

考察京尼平對絲素/多肽膜結(jié)構(gòu)的影響，對比加入0.1%（w/v）甘油條件下絲素/多肽風(fēng)干膜的斷裂強(qiáng)力和斷裂伸長率，結(jié)果見圖8。

從圖8中可以看出，京尼平處理后絲素膜材料的拉伸強(qiáng)度略有增加，這是由于絲素蛋白和多肽經(jīng)京尼平交聯(lián)后發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，其分子間作用力加強(qiáng)，拉伸強(qiáng)度增加。在受到外力拉伸時，SF+P和SF+GP+P膜中大分子鏈段間的滑動能力降低，膜材料斷裂伸長率略有下降。

圖8 絲素/多肽風(fēng)干膜的機(jī)械性能Fig.8 Mechanical properties of the air-dried fibroin/polypeptide membranes

2.5 絲素接枝多肽對酪氨酸酶催化接枝ε-PL的影響

絲素蛋白接枝含酪氨酸多肽后，其酪氨酸含量增加，有利于提高酪氨酸酶催化氧化絲素產(chǎn)生更多醌類活性基[14-16]。可進(jìn)一步實現(xiàn)酶促絲素中醌類基團(tuán)與外源功能性氨基化合物（如殼聚糖等）反應(yīng)，改善絲素蛋白材料的應(yīng)用性能[17]。實驗中以ε-PL氨基化合物模型物，考察經(jīng)京尼平改性后絲素膜在酪氨酸酶催化下接枝ε-PL的效果，見圖9。

圖9 酪氨酸酶催化聚賴氨酸接枝多肽改性絲素膜Fig.9 Tyrosinase-catalysed grafting ε-Poly-L-Lysine on silk fibroin treated by polypeptide

由圖 9可知，SF/ε-PL樣品的吸附/接枝率為9.54%，其原因是ε-PL含有較多氨基，ε-PL等電點pI在9左右，而絲素蛋白pI為4.2～4.5，兩者可依靠庫侖力、范德華力或氫鍵結(jié)合，吸附在絲素膜表面。SF/TYR+ε-PL樣品中 ε-PL的吸附/接枝率為19.99%，高于SF/ε-PL，表明酪氨酸酶可催化ε-PL接枝絲素。SF+GP+P/TYR+ε-PL上ε-PL的吸附/接枝率為37.43%，高于其他樣品，表明絲素接枝含酪氨酸多肽后其反應(yīng)性增強(qiáng)，酪氨酸酶催化絲素氧化的反應(yīng)位點增多，因此ε-PL在絲素膜表面的接枝效率提高。

3 結(jié) 語

1）京尼平能促進(jìn)絲素蛋白與含酪氨酸多肽中伯胺基之間反應(yīng)，引發(fā)生成梔子藍(lán)色素；京尼平處理后絲素/多肽體系的蛋白分子量增加，實現(xiàn)了多肽在絲素蛋白表面的接枝。

2）含酪氨酸多肽和絲素交聯(lián)后，不僅使絲素膜材料的熱穩(wěn)定性提高，也在一定程度上增加了絲素蛋白膜材料的機(jī)械性能。

3）多肽在絲素蛋白分子表面接枝后，使得絲素蛋白中酪氨酸含量增加，提高了酪氨酸酶催化ε-PL在絲素表面的接枝效果，驗證了通過接枝含酪氨酸多肽可提高絲素的酶促反應(yīng)性。