高抵抗素血癥介導(dǎo)的自發(fā)性高血壓大鼠左室肥厚與GLUT4的相關(guān)性

韓彬，張衛(wèi)，曾卓，周玉良，鄭志鵬，李熾昌

抵抗素是由脂肪細(xì)胞分泌的一種信號(hào)分子，它通過(guò)影響葡萄糖的代謝來(lái)對(duì)抗胰島素的功能，是聯(lián)系肥胖與胰島素抵抗之間的一種新型獨(dú)特信號(hào)分子。有研究顯示抵抗素水平與左室重量以及心肌功能障礙是獨(dú)立相關(guān)的[1]，但機(jī)制尚不明確。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）是存在于細(xì)胞膜上的一種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是目前已知的14種促進(jìn)跨膜己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）家族成員之一，主要存在于脂肪組織、骨骼肌及心肌組織中，是心肌組織功能的重要組成部分，GLUT4水平與左室肥厚的發(fā)生有一定聯(lián)系[2]，但抵抗素導(dǎo)致的左室肥厚是否與GLUT4水平變化有關(guān)，尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究在高血壓大鼠的基礎(chǔ)上，通過(guò)注射載有抵抗素基因的腺病毒，以觀察不同水平的抵抗素對(duì)肥厚心肌組織中GLUT4表達(dá)的影響，探索抵抗素導(dǎo)致左室肥厚的分子學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑10周齡自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）36只（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），雄性，體重（220±15）g，載有抵抗素的重組腺病毒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；大鼠抵抗素（Resistin）ELISA檢測(cè)試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司）；兔抗鼠Tubulin一抗、兔抗鼠GLUT4一抗以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 研究分組將36只10周齡高血壓大鼠（雄性），隨機(jī)平均分成病毒組及空白對(duì)照組（每組各18只）。其中病毒組經(jīng)尾靜脈注射載有抵抗素基因的重組腺病毒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供）1×108PFu/mouse（用生理鹽水稀釋至0.3 ml）5 d后隨機(jī)平均分成第1周組、第4周組、第8周組3組（每組6只）；而空白對(duì)照組則經(jīng)尾靜脈注射等體積生理鹽水后隨機(jī)平均分為第1周組、第4周組、第8周組3組（每組6只）。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1 左室重量指數(shù)、胰島素及抵抗素水平于對(duì)應(yīng)周數(shù)測(cè)量大鼠體重，取材，采集清晨空腹12 h以上的大鼠靜脈血3～4 ml，半數(shù)采用放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素水平，另一半離心后取血清儲(chǔ)存在-70 ℃冰箱中，采用競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定血清抵抗素水平，試劑配置及操作均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；分離左心室，生理鹽水沖洗后濾紙吸干水分，測(cè)定左室重量并計(jì)算重量指數(shù)。

1.3.2 心肌組織HE染色心肌組織經(jīng)甲醛固定24 h，經(jīng)脫水、包埋后經(jīng)病理切片設(shè)備（常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司）進(jìn)行切片，常規(guī)HE染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化。

1.3.3 Western blot檢測(cè)心肌組織中GLUT4水平4℃PBS漂洗心肌組織，稱取100 mg組織并剪碎，加入1ml 4 ℃預(yù)冷的組織裂解液，反復(fù)研磨至無(wú)組織塊，吸取研磨器中液體4 ℃ 12000 g離心15min，取上清液用Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配置10%分離膠和5%濃縮膠，向加樣孔中加入30 μg總蛋白和預(yù)染Mark 3 μl，以80 V電壓電泳30 min后換用120 V繼續(xù)電泳90 min，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h后，TBST緩沖液洗膜3次，加入兔抗鼠Tubulin一抗（1：1000稀釋）及兔抗鼠GLUT4一抗（1：1000稀釋），4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。回收一抗，經(jīng)TBST緩沖液沖洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，搖床孵育1 h。TBST緩沖液沖洗，使用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光，在暗盒膠片上曝光1～5 min，顯影、定影后觀察結(jié)果，采用ImageJ圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描和分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理，各組計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高抵抗素血癥大鼠模型的鑒定采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠抵抗素水平，病毒組大鼠血清抵抗水平在第1周及第4周較對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）（表1）。

2.2 抵抗素對(duì)空腹胰島素及左室重量指數(shù)的影響與對(duì)照組相比，病毒組空腹胰島素水平在第1周以及第4周組中顯著性升高（P＜0.05），在第4周及第8周組中，病毒組左室重量指數(shù)較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）（表2）。

表1 各組大鼠的血清抵抗素的比較（±s）

表1 各組大鼠的血清抵抗素的比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05

分組 抵抗素（μ g/L）病毒組 第一周 1.9 5±0.1 0 a第四周 2.4 8±0.2 9 a第八周 2.2 0±0.1 9對(duì)照組 第一周 1.3 0±0.0 9第四周 1.9 9±0.2 6第八周 2.1 8±0.2 5

表2 各組大鼠空腹胰島素及左室重量指數(shù)的比較（±s）

表2 各組大鼠空腹胰島素及左室重量指數(shù)的比較（±s）

注：表示與對(duì)照組相比，aP＜0.05

分組 胰島素（m I U/L） 抵抗素（μ g/L）病毒組 第1周 1.1 2±0.2 9 a 3.1 2±0.1 2第4周 1.3 5±0.1 2 a 3.8 8±0.1 4 a第8周 0.8 8±0.1 8 3.9 2±0.1 5 a對(duì)照組 第1周 0.8 1±0.0 7 3.1 5±0.1 5第4周 0.9 0±0.0 8 3.3 1±0.0 9第8周 0.8 5±0.1 4 3.3 5±0.1 1

2.3 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)及排列變化第1周組中，病毒組大鼠心肌細(xì)胞與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)及排列改變輕微。在第4周組中，病毒組大鼠較對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肥大，排列紊亂，而在第8周組，病毒組大鼠心肌細(xì)胞改變更加明顯，部分心肌纖維斷裂，胞漿溶解壞死，心肌組織間邊界模糊（圖1）。

2.4 心肌組織中GLUT4的表達(dá)灰度分析顯示，在第1周、第4周及第8周中，對(duì)照組GLUT4水平較病毒組明顯升高，GLUT4水平與抵抗素呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（圖2～3）。

2.5大鼠心肌組織GLUT4與血清抵抗素水平的相關(guān)性分析顯示抵抗素水平與GLUT4呈負(fù)相關(guān)（r=-0.45，P=0.006）（圖4）。

圖1 大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)及排列變化

圖2 心肌組織中GLUT4及Tubulin的表達(dá)

圖3 病毒組與對(duì)照組心肌組織中GLUT4的表達(dá)

2.6 不同組大鼠心肌組織中GLUT4的mRNA的表達(dá)β-actin及GLUT4的溶解曲線均呈單峰，無(wú)雜峰，提示無(wú)非特異性二聚體類產(chǎn)物，熒光定量結(jié)果可靠，對(duì)比病毒組與對(duì)照組GLUT4的mRNA的Real-time PCR結(jié)果，第1周、第4周及第8周組，病毒組GLUT4的mRNA的表達(dá)較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5～6）。

2.7 大鼠心肌組織中GLUT4 mRNA水平與抵抗素水平分析抵抗素水平與GLUT4 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.415，P=0.012）（圖7）。

3 討論

左室肥厚是心臟為了適應(yīng)過(guò)度的壓力負(fù)荷發(fā)生的心肌重構(gòu)，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的肥大以及心肌的纖維化，是心衰、心律失常、心梗等不良事件的危險(xiǎn)因素之一[3]，在高血壓患者中有20%～40%合并有左室肥厚的發(fā)生，我們前期[4]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血清抵抗素與左室肥厚呈正相關(guān)，可能是左室肥厚發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素之一。

圖4 抵抗素水平與GLUT4的相關(guān)性分析

圖5 GLUT4及內(nèi)參的擴(kuò)增及溶解曲線

圖6 病毒組與對(duì)照組GLUT4 mRNA表達(dá)

圖7 抵抗素與GLUT4 mRNA水平的相關(guān)性分析

GLUT4是心肌組織供能的重要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病心肌病中GLUT4的表達(dá)下降[5]，這種現(xiàn)象也存在于小鼠擴(kuò)張型心肌病[6]及長(zhǎng)期大量攝入酒精的大鼠心肌中[7]，GLUT4基因敲除的小鼠可以出現(xiàn)顯著心肌肥厚[8]。類似于上述研究，我們的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)注射載有抵抗素基因的重組腺病毒，病毒組與對(duì)照組相比，抵抗素水平明顯上升，心肌組織中GLUT4的表達(dá)量明顯下降，心肌的左室重量指數(shù)增加，由此我們認(rèn)為肥厚心肌中的GLUT4表達(dá)是下降的，并且GLUT4表達(dá)的下調(diào)與抵抗素水平的上升有關(guān)。

故抵抗素可以通過(guò)下調(diào)高血壓大鼠心肌GLUT4的表達(dá)而導(dǎo)致左室肥厚的發(fā)生。我們的研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素水平的升高可以引起高血壓大鼠體內(nèi)胰島素水平的增高、胰島素抵抗的發(fā)生。胰島素抵抗可能通過(guò)以下幾種機(jī)制引起大鼠心肌組織GLUT4表達(dá)下降：①胰島素水平升高導(dǎo)致一些微小RNA過(guò)表達(dá)，如miR-93、miR-223[9,10]，從而引起組織中GLUT4表達(dá)量的下降；②代謝綜合癥大鼠有胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，心肌組織中GLUT4表達(dá)下降，其中白介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）炎癥介質(zhì)水平的升高可能起一定的作用[11]；③糖尿病合并有嚴(yán)重的胰島素抵抗的患者，肌肉組織中的GLUT4表達(dá)的下降與泛素結(jié)合酶9（UBC9）表達(dá)的下降有關(guān)[12]；④在骨骼肌胰島素抵抗模型中，胰島素抵抗可以通過(guò)影響p38MAPK途徑來(lái)影響GLUT4的表達(dá)，使用改善胰島素抵抗的藥物后骨骼肌中GLUT4的水平上升[13]；⑤苦瓜提取物也能改善胰島素抵抗，引起肌肉組織中GLUT4表達(dá)的上升[14]。

綜上所述，本文認(rèn)為GLUT4表達(dá)的下降在抵抗素介導(dǎo)的高血壓大鼠左室肥厚中發(fā)揮著一定的作用，抵抗素水平的升高導(dǎo)致了高血壓大鼠胰島素抵抗的發(fā)生，通過(guò)上述可能的途徑引起了GLUT4的表達(dá)量下降，最終導(dǎo)致了大鼠左室肥厚的發(fā)生。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，不僅為高血壓合并左室肥厚患者的治療提供了新靶點(diǎn)，同時(shí)也為高血壓患者合并高抵抗素血癥的干預(yù)提供了新的證據(jù)。