蒙古扁桃藥材和柄扁桃藥材不同部位生物堿含量測(cè)定及比較*

周紅兵，郝海梅，劉 慶，高 晨，石松利,2，白迎春，王 佳，白萬(wàn)富

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院蒙中藥活性物質(zhì)與功能研究所)

蒙古扁桃(Amygdalus mongolica Maxim)和柄扁桃(Prunus pedunculata)均為阿拉善荒漠種，屬于薔薇科扁桃屬多年旱生落葉灌木，為蒙古高原所特有，自然分布于我國(guó)西北干旱、半干旱地區(qū)山地和沙漠之地[1]。蒙古扁桃種仁和柄扁桃種仁均是內(nèi)蒙古西部地區(qū)傳統(tǒng)中藥材“郁李仁”的主要替代品，性平味苦，有止咳化痰、潤(rùn)腸通便之功效[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，蒙古扁桃和柄扁桃種仁中含有苦杏仁苷、不飽和脂肪酸、多糖、黃酮及微量元素等[3]。蒙古扁桃與柄扁桃所含的化學(xué)成分相似，但含量卻不同。鈕樹(shù)芳[4]等研究發(fā)現(xiàn)，蒙古扁桃較柄扁桃中Ca、Mg、Cu、Zn含量高，F(xiàn)e、Mn含量則顯著低于柄扁桃。吳培賽[5-7]等研究發(fā)現(xiàn)，蒙古扁桃藥材具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠顯著降低高脂血癥的血脂水平，對(duì)肝臟纖維化具有良好的保護(hù)作用。白迎春[8-9]等研究表明，柄扁桃種仁具有一定的降血脂作用，并且可以保護(hù)肝臟。蒙古扁桃始于大自然，富含一些如生物堿類(lèi)[10]、黃酮類(lèi)[11]、揮發(fā)油和有機(jī)酸[12]等較為特殊的生理活性成分。但有關(guān)蒙古扁桃藥材和柄扁桃藥材中生物堿含量測(cè)定與比較未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

生物堿在中草藥中廣泛分布，是由各種生物(包括細(xì)菌、真菌和植物)產(chǎn)生的、具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物[13]。生物堿類(lèi)化合物具有驅(qū)蟲(chóng)、抗炎平喘、抑菌抗病毒等功效[14]，在抗腫瘤[15]、防治心血管疾病[16]、降糖[17]中也表現(xiàn)出很強(qiáng)生理活性。本研究測(cè)定了蒙古扁桃種仁和柄扁桃種仁中總生物堿的含量，目的是為其生物堿含量測(cè)定探求一套簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、便捷可靠的方法，為挖掘蒙古扁桃藥材和柄扁桃藥材中的活性物質(zhì)、研究其化學(xué)成分及藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)和資源的合理利用提供實(shí)驗(yàn)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1藥材來(lái)源 蒙古扁桃種仁及葉片，采于內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市九峰山，經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院石松利教授鑒定為薔薇科扁桃屬植物蒙古扁桃干燥成熟種子和新鮮葉片；柄扁桃種仁及葉片，采自?xún)?nèi)蒙古自治區(qū)包頭市忽雞溝，由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院石松利教授鑒定為薔薇科扁桃屬植物柄扁桃的干燥成熟種子和新鮮葉片。見(jiàn)表1。

表1 蒙古扁桃及柄扁桃樣品來(lái)源

1.2試劑與儀器 硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：5908-99-6)，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；石油醚(分析純)；95 %乙醇(分析純)；氯仿(分析純)；2 %硫酸(分析純)；5 %碳酸鈉(分析純)；溴甲酚綠；鄰苯二甲酸氫鉀等。索氏提取器；回流提取裝置；抽濾裝置；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；FA1204B電子天平(上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)；UV-1780紫外分光光度計(jì)(日本島津)；分液漏斗；移液管；容量瓶等。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1總生物堿樣品溶液的制備 本研究所使用的蒙古扁桃及柄扁桃藥材種仁和葉片總生物堿樣品溶液制備方法流程圖如下所示，見(jiàn)圖1。

2.1.2溴甲酚綠緩沖溶液的制備 本研究所使用的溴甲酚綠緩沖溶液制備方法流程圖如下所示，見(jiàn)圖2。

圖1 蒙古扁桃及柄扁桃藥材種仁和葉片中總生物堿樣品溶液制備流程

圖2 溴甲酚綠緩沖溶液的制備流程

2.1.3對(duì)照品硫酸阿托品溶液的制備 本研究所使用的對(duì)照品硫酸阿托品溶液制備方法流程圖如下所示，見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照品硫酸阿托品溶液制備流程

2.2最佳測(cè)定波長(zhǎng)的確定 將對(duì)照品硫酸阿托品溶液、種仁及葉片總生物堿樣品溶液和空白溶液，分別置于1 cm比色池中，對(duì)200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。對(duì)照品硫酸阿托品溶液和總生物堿樣品溶液分別顯色后于418 nm處均有最大吸收值，因此選用418 nm作為最佳測(cè)定波長(zhǎng)。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密量取對(duì)照品硫酸阿托品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL分液漏斗中，分別加水至7 mL，加溴甲酚綠緩沖溶液4 mL，上下?lián)u勻。隨后分別加入15 mL氯仿，震蕩3 min，搖勻，靜置1 h。分別取下層氯仿溶液于25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度線(xiàn)再次定容，震蕩搖勻，于所確定的最佳波長(zhǎng)418 nm下測(cè)定其吸光度?？v坐標(biāo)為所測(cè)吸光度值，橫坐標(biāo)為對(duì)照品硫酸阿托品質(zhì)量濃度(μg/ mL)，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，所得回歸方程為y=0.0988x+0.0826，R=0.997，總生物堿在2～12 μg/ mL的濃度范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照品硫酸阿托品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.4精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確量取對(duì)照品硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，于最佳波長(zhǎng)418 nm下平行測(cè)定吸光度5次。結(jié)果顯示對(duì)照品硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液RSD=1.18 %，表明本實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好，符合實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定的要求。見(jiàn)表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別量取柄扁桃藥材種仁與葉片總生物堿樣品溶液1 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所建立的方法顯色后，分別對(duì)其進(jìn)行5次平行吸光度測(cè)定實(shí)驗(yàn)，測(cè)得柄扁桃藥材種仁總生物堿樣品溶液RSD=1.23 %；柄扁桃藥材葉片總生物堿樣品溶液RSD=1.12 %。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別量取柄扁桃藥材種仁與葉片總生物堿樣品溶液1 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所建立的方法顯色后，在室溫條件下放置0、2、4、6、8、12 h，按照上述方法進(jìn)行吸光度檢測(cè)，計(jì)算所得柄扁桃藥材種仁與葉片總生物堿樣品溶液的RSD值分別為1.21 %、1.06 %。結(jié)果表明總生物堿樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)

2.7.1柄扁桃種仁總生物堿樣品溶液加樣回收率測(cè)定 取6份柄扁桃種仁總生物堿樣品溶液各1 mL，分別置于10 mL容量瓶中，分別加入1 mL、1 mL、2 mL、2 mL、3 mL、3 mL的對(duì)照品硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容后充分震蕩搖勻，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所建立的方法顯色后，于最佳波長(zhǎng)418 nm下檢測(cè)吸光度并計(jì)算回收率?；厥章?(實(shí)驗(yàn)測(cè)值-樣品中總生物堿含量)/對(duì)照品硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液加入量×100 %。計(jì)算所得平均回收率=98.83 %，RSD=1.40 %(n=6)。見(jiàn)表5。

表5 柄扁桃種仁總生物堿樣品溶液加樣回收率測(cè)試結(jié)果

2.7.2柄扁桃葉片總生物堿樣品溶液加樣回收率測(cè)定 取6份柄扁桃葉片總生物堿樣品溶液各1 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，分別加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL的對(duì)照品硫酸阿托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，定容后充分震蕩搖勻，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所建立的方法顯色后，于418 nm下檢測(cè)吸光度并計(jì)算回收率。(回收率計(jì)算同“3.4.1”)測(cè)得平均回收率=98.64 %，RSD=0.71 %(n=6)。見(jiàn)表6。

表6 柄扁桃葉片總生物堿樣品溶液加樣回收率測(cè)試結(jié)果

x=(A-b)VF/(C×m)

式中:x—樣品中總生物堿的質(zhì)量濃度，mg/g

A—稀釋后樣品的吸光度

b—標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距

C—標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率

V—測(cè)定吸光度時(shí)樣品提取液稀釋體積，mL

F—樣品提取液與測(cè)定時(shí)吸取樣品提取液體積比值

m—樣品質(zhì)量，g

表7 蒙古扁桃種仁和柄扁桃種仁中總生物堿含量

注：a為與蒙古扁桃比較，P<0.05

表8 蒙古扁桃葉片和柄扁桃葉片中總生物堿含量

注：a為與蒙古扁桃比較，P<0.05

表9 蒙古扁桃及柄扁桃種仁和葉片中總生物堿含量

注：a為與種仁中總生物堿含量比較，P<0.05

3 討論

生物堿含量測(cè)定方法有分光光度法、酸性染料比對(duì)法、酶聯(lián)免疫吸附法、滴定法以及高效液相色譜法等[18]。本研究采用了酸堿提取法提取總堿，用硫酸阿托品作為對(duì)照品，酸性染料比色法測(cè)定蒙古扁桃藥材及柄扁桃藥材種仁及葉片中總生物堿的方法。其中，酸堿提取法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性較好，但靈敏度稍低；酸性染料比色法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單且重現(xiàn)性好，近年來(lái)已被大量應(yīng)用于中藥材總生物堿含量的測(cè)定中[19]。

生物堿是一類(lèi)含氮有機(jī)化合物其主要存在于植物體內(nèi)，多呈堿性，具有抗腫瘤、抗炎抑菌、抗病毒、抗心律失常、鎮(zhèn)痛、解痙等生物活性[20]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其能夠防治非酒精性脂肪肝病[21]。生物堿作為一類(lèi)重要的天然藥物化學(xué)成分，對(duì)其進(jìn)行不斷深入研究更加有助于我國(guó)中草藥的資源開(kāi)發(fā)與利用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：(1)蒙古扁桃藥材種仁中總生物堿含量為0.2039 mg/g，柄扁桃藥材種仁中總生物堿含量為0.1472 mg/g，蒙古扁桃藥材中生物堿含量顯著高于柄扁桃藥材中生物堿含量(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(2)蒙古扁桃藥材葉片中總生物堿含量為0.3438 mg/g，柄扁桃藥材葉片中總生物堿含量為0.3215 mg/g，蒙古扁桃藥材葉片中生物堿含量明顯高于柄扁桃藥材葉片中生物堿含量(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)蒙古扁桃藥材及柄扁桃藥材葉片中總生物堿含量顯著高于其種仁中總生物堿含量(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)而確定此方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，可靠，重復(fù)性好，可作為蒙古扁桃藥材和柄扁桃藥材總生物堿的含量測(cè)定方法，同時(shí)也可為扁桃屬藥用植物總生物堿的提取及含量測(cè)定提供指導(dǎo)方法。本研究結(jié)果為蒙古扁桃藥材和柄扁桃藥材化學(xué)成分的研究、活性物質(zhì)的挖掘以及資源的持續(xù)性合理開(kāi)發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)與科學(xué)依據(jù)。