甲狀腺癌免疫細胞浸潤模式及預后的相關性分析*

詹雪冰，董芳嬡，盧林明，孫恩濤，陶香香，陳 冰

(1.皖南醫(yī)學院病理教研室，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學院檢驗學院)

甲狀腺癌(thyroid carcinoma)是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，全球甲狀腺癌56.7萬例，發(fā)病率居世界第九位[1]。甲狀腺癌中最常見的2種病理類型為甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡狀癌,可占到總發(fā)病人數的90 %[2]。未分化甲狀腺癌往往具有高侵襲性、高病死率的特點，并且預后差[3]，這是治療上的一個挑戰(zhàn)。

由于免疫學和腫瘤學發(fā)展的不斷深入以及交叉滲透,腫瘤免疫學漸漸成為腫瘤治療的新熱點,為腫瘤治療帶來新的希望[4]。關于惡性腫瘤預后與宿主全身免疫反應的相關性已經被大量研究證實, 治療前的免疫相關指標往往能反映惡性腫瘤患者的預后[5]。相對于傳統(tǒng)的治療，腫瘤免疫治療具有免疫記憶和無副作用等優(yōu)點，因此要對癌癥免疫有更深入的研究。本文利用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)中甲狀腺癌的表達譜數據, 并利用CIBERSORT計算其免疫細胞組成, 進一步分析其與甲狀腺癌預后的相關性。

1 材料與方法

1.1數據來源 從公共數據庫TCGA(https://cancergenome.nih.gov/)中下載基因轉錄本數據共570例, 包含甲狀腺癌組織512例、正常甲狀腺組織58例(到2019年7月為止)。下載的表達數據類型為HTSeq-FPKM。下載的甲狀腺癌樣本相關臨床數據包含性別、生存時間、生存狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分級、TNM分期。

1.2利用Cibersort計算組織中免疫細胞構成 提取甲狀腺癌組織及正常組織轉錄本的mRNA表達譜數據, 使用R語言limma包對數據進行校正。腫瘤浸潤免疫細胞的計算采用CIBERSORT算法，CIBERSORT是一種用于量化22種浸潤的免疫細胞組成的分析工具。這22個免疫細胞包括M1巨噬細胞、M2巨噬細胞、M0巨噬細胞、濾泡輔助性T細胞、未活化的CD4+記憶性T細胞、活化的CD4+記憶性T細胞、γδT細胞、CD8+T細胞、調節(jié)性T細胞、幼稚CD4+T細胞、未活化的自然殺傷細胞、活化的自然殺傷細胞、未活化的肥大細胞、活化的肥大細胞、記憶性B細胞、靜息態(tài)樹突狀細胞、活化的樹突狀細胞、幼稚B細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和漿細胞。為提高精度，對每個樣本以CIBERSORTP值<0.05為標準篩選，篩選出有意義的樣本數據(甲狀腺癌樣本169，正常樣本19)。選擇符合過濾條件的TCGA數據集中腫瘤浸潤免疫細胞進行相關分析并結合臨床信息樣本進行后續(xù)臨床分析。將過濾后的免疫細胞表達矩陣與TCGA的臨床信息矩陣融合，并對過濾的免疫細胞的生存分析以及免疫細胞與腫瘤分期的相關性進行評價。

1.3統(tǒng)計分析 所有分析均使用R軟件進行。且分析采用CIBERSORT經過篩選后的病例。用barplot R包，pheatmap R包，vioplot R包分別進行每種免疫細胞占比柱狀圖、免疫細胞表達熱圖以及小提琴圖的繪制。用corrplot R包檢測不同免疫細胞間的相關性。生存R包用于Kaplan-Meier曲線分析。采用perl分析過濾后的免疫細胞與TNM分期的相關性。

2 結果

2.1甲狀腺癌樣本臨床信息 從TCGA數據庫中下載基因轉錄本數據及相關臨床數據。TCGA中共登記509例確診為甲狀腺癌的患者，包括患者年齡、性別、腫瘤分期等詳細臨床特征。見表1。

2.2甲狀腺癌中浸潤免疫細胞情況 所有樣本中，有169例腫瘤樣本和19例正常樣本符合CIBERSORT標準，P< 0.05。在甲狀腺癌和正常組織中未發(fā)現(xiàn)CD4幼稚T細胞的明顯比例。因此分析其他21種浸潤免疫細胞的表達特征矩陣并繪制每種免疫細胞占比的柱狀圖、甲狀腺癌及正常組織中免疫細胞的熱圖、甲狀腺癌及正常組織中免疫細胞成分小提琴圖以及甲狀腺癌組織樣本中每種免疫細胞水平相關圖。見圖1-4。

表1 TCGA中甲狀腺癌的臨床特點

注：NA表示未知

圖1 所有樣本中21種免疫細胞占比的柱狀圖

圖2 所有樣本中21種免疫細胞含量熱圖

由圖1及圖2可見,在甲狀腺癌組織中浸潤水平最高的五種免疫細胞類型分別是:M0巨噬細胞、未活化的CD4+記憶性T細胞、漿細胞、M2巨噬細胞、CD8+T細胞。由圖3可見在正常組織中，CD8+T細胞、未活化的CD4+記憶性T細胞、漿細胞、幼稚B細胞和記憶B細胞的浸潤率最高。與正常組織相比，M0巨噬細胞、M2巨噬細胞以及靜息態(tài)樹突狀細胞以及未活化的肥大細胞的比例普遍較高(P<0.001)。與腫瘤組織相比，正常組織中幼稚B細胞、CD8+T細胞、濾泡輔助性T細胞、γδT細胞的比例普遍較高(均P< 0.01)。由圖4可見在甲狀腺癌組織中, 構成比相關系數較大的免疫細胞包括:M0巨噬細胞與CD8+T細胞(-0.59), M0巨噬細胞與漿細胞(-0.56), CD8+T細胞與漿細胞(0.49)，CD8+T細胞與M1巨噬細胞(0.46)。

2.3甲狀腺癌免疫細胞浸潤與預后的關系 利用R語言中的survival包計算免疫細胞浸潤程度與生存的相關性, 具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的細胞包括M0巨噬細胞和CD8+T細胞, 其中M0巨噬細胞構成比例高者生存期短, CD8+T細胞構成比高者生存期長, 生存曲線。見圖5。

圖4 甲狀腺癌組織樣本中每種免疫細胞占比相關圖

2.4免疫細胞和臨床相關性的分析 評估免疫細胞與原發(fā)腫瘤(T)分期的相關性。T1-2期腫瘤中活化的樹突狀細胞, CD4+記憶性T細胞, 靜息態(tài)樹突狀細胞, 未活化的肥大細胞、單核細胞明顯低于T3-4期腫瘤(P<0.05)。T1-2期腫瘤中γδT細胞和漿細胞明顯高于T3-4期腫瘤(P< 0.05)。見圖6。

圖5 免疫細胞構成水平的生存曲線

圖6 免疫細胞與原發(fā)腫瘤(T)分期的相關性

3 討論

最新的觀點認為,巨噬細胞在免疫微環(huán)境中主要發(fā)揮腫瘤促進的功能, 與多種腫瘤的侵襲性行為相關, 與腫瘤病人的不良預后相關[6]?？梢罁δ軐⒕奘杉毎譃镸1和替代型M2巨噬細胞[7]。把握和控制M1、M2型巨噬細胞之間的平衡是探索疾病治療新方法的切入點[8]。本研究發(fā)現(xiàn)M0，M2巨噬細胞在甲狀腺癌患者中表現(xiàn)為高充盈，M0巨噬細胞構成比例高者生存期短?？赡芴崾驹谀[瘤進展期間, 巨噬細胞將被逐漸募集到腫瘤組織中, 改變腫瘤微環(huán)境以調節(jié)腫瘤進展。

本研究結果顯示, 高水平的CD8+T細胞與甲狀腺癌患者較好的生存率相關。在既往對腫瘤免疫細胞的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關中性粒細胞的消耗導致活化的CD8+T細胞增加并減緩腫瘤的生長[9-10]。本研究表明，CD8+T細胞可以提高甲狀腺癌患者生存率。

單核細胞可以間接促進細胞外基質降解和腫瘤血管新生, 繼而促進腫瘤的進展和轉移[11]。本研究表明, 高比例的單核細胞與胃癌患者較差的預后相關, 進一步證明單核細胞在促進腫瘤發(fā)展中的作用。

在腫瘤環(huán)境中, 肥大細胞刺激血管生成從而導致腫瘤的生長和發(fā)展[12]。本研究顯示未活化的肥大細胞比例在甲狀腺癌患者中較高，且未活化的肥大細胞含量在甲狀腺癌患者T3和T4期的中也表現(xiàn)為高充盈狀態(tài)，這可能提示肥大細胞在甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起促進作用。

本研究表明，靜息態(tài)樹突狀細胞在甲狀腺癌中富集分數增加，并且較T1和T2期，在T3和T4期靜息態(tài)樹突狀細胞和活化樹突狀細胞比例都增加。這與之前針對乳頭狀甲狀腺癌的研究一致[13]，在正常的甲狀腺組織中很少發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞，但在乳頭狀甲狀腺癌中不成熟表型的樹突狀細胞增多，從而抑制免疫反應。

綜上所述，CIBERSORT在分析整個組織的組織表達數據中非常重要，它提供關于甲狀腺癌免疫細胞的明確信息。確定浸潤性免疫細胞與甲狀腺癌進展之間的關系, 發(fā)現(xiàn)浸潤性免疫細胞在甲狀腺癌癌中的預測作用，并且與臨床結果密切相關。甲狀腺癌免疫細胞與正常組織免疫細胞的差異可能成為免疫治療鑒定的新途徑，為甲狀腺癌患者的治療策略提供參考。