小兒膿毒癥休克相關(guān)基因的篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

凌家梅,胡 林,陳 雪,楊蕊萍,胡迎春

(1. 四川省雅安市蘆山縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 雅安 625600；2. 四川省雅安市蘆山縣人民醫(yī)院兒科，四川 雅安 625600；3. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診科，四川 瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000)

膿毒癥由是嚴(yán)重感染導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)[1-2]，而膿毒癥休克是其嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其死亡率極高[3]，而小兒膿毒癥是兒科急診中的危急重癥，膿毒癥可以引起患兒微循環(huán)障礙、免疫功能失調(diào)及組織器官功能障礙,膿毒癥休克更是嚴(yán)重威脅著患兒的生命[4]。在膿毒癥治療方面除了早期的液體復(fù)蘇、抗菌感染、以及其他的對癥處理和相關(guān)并發(fā)癥的防治外[5-6]，還有許多新的實(shí)踐，例如連續(xù)血液凈化治療的應(yīng)用對于改善小兒膿毒癥的急性腎損傷有一定的意義[7]。但目前對于小兒膿毒癥的認(rèn)知還不夠深入，對疾病本身的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍然不夠清楚，因而沒有一個有效的診療策略來提高該病的治愈率，或者是更為有效的方法來提前預(yù)知它的爆發(fā)，找到相應(yīng)的靶點(diǎn)從而中斷它的進(jìn)程。

隨著科學(xué)技術(shù)以及大數(shù)據(jù)的發(fā)展，基于生物信息學(xué)技術(shù)而進(jìn)行的相關(guān)分析或許可以使膿毒癥休克的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制變得更加清晰，同時為膿毒癥休克的治療提供潛在的靶點(diǎn)基因，以期達(dá)到預(yù)防和治療的目的。

通過下載GSE26378來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理并識別出差異基因，同時進(jìn)行功能富集分析及通路分析以獲得小兒膿毒癥休克與SIRS之間的本質(zhì)區(qū)別，并建立了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和基因信號網(wǎng)絡(luò)，通過對這些網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及核心基因的探究，旨在全局認(rèn)識小兒膿毒癥休克并找到一些可能的核心基因。

1 材料與方法

1.1 材料

從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI創(chuàng)建的公共數(shù)據(jù)平臺)下載了小兒膿毒癥休克與SIRS的芯片數(shù)據(jù)GSE26378，這個芯片數(shù)據(jù)包括了29例小兒膿毒癥休克與29例SIRS患兒的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

通過將原始的數(shù)據(jù)樣本發(fā)送到GCBI(https://www.gcbi.com.cn/)在線軟件的分析實(shí)驗(yàn)室，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化處理使樣本芯片數(shù)據(jù)更具有可比性，并進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選(P<0.05,FC>1.5倍)。

1.3 差異基因的GO分析

基因本體(Gene Ontology，GO)論分析是一種廣泛應(yīng)用于生物信息學(xué)領(lǐng)域的分析方法，它將篩選出來的差異基因進(jìn)行簡單的注釋，主要包括基因的生物學(xué)功能、途徑及細(xì)胞中的定位[8]。將生物學(xué)進(jìn)程設(shè)置為本次分析的類型，基因顯著性富集的臨界參數(shù)為(P<0．05、FDR<0．05)。

1.4 信號通路分析及基因信號網(wǎng)絡(luò)分析

KEGG是一個巨大的生物信息數(shù)據(jù)庫，通過提交篩選出來的差異基因數(shù)據(jù)，應(yīng)用KEGG中的功能通路分析，從而了解到差異基因的高級功能及所屬的生物系統(tǒng)[9]。本研究找到了差異基因在KEGG功能通路中所處的位點(diǎn)并建立了信號通路網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中各基因的上、下游關(guān)系篩選出可能的核心基因。

1.5 基因共表達(dá)分析

基因共表達(dá)分析是近年來比較流行的基因篩選方法，是基于基因表達(dá)特征的相似性而進(jìn)行的模塊分類。通過共表達(dá)分析，建立共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，可以找到各差異基因表達(dá)值的相關(guān)關(guān)系，并且比較直觀的發(fā)現(xiàn)處于核心部位的基因，為進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

2 結(jié)果分析

2.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果

通過對兩組(膿毒癥休克/SIRS)數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因篩選，共獲得1 456個差異基因(P<0.05)，其中下調(diào)基因859個，上調(diào)基因597個(見圖1)。經(jīng)火山圖可知該數(shù)據(jù)上、下調(diào)基因分布基本均勻。

2.2 差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果

差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，top10的生物進(jìn)程為：1有絲分裂細(xì)胞周期2有絲分裂細(xì)胞周期M期3細(xì)胞分裂4依賴于DNA的轉(zhuǎn)錄5有絲分裂中期6有絲分裂后期7蛋白質(zhì)磷酸化8病毒與宿主的相互作用9細(xì)胞凋亡的過程10聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(見圖2)

2.3 差異表達(dá)基因通路富集分析

總共有59條通路富集于網(wǎng)絡(luò)中。主要的通路有：MAPK信號通路、P53信號通路、wnt信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路、細(xì)胞周期受體信號通路(見圖3)。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 DEGs

注：圖中橫坐標(biāo)為相對差異倍數(shù)(log2(FC))；左側(cè)為下調(diào)基因，右側(cè)為上調(diào)基因；縱坐標(biāo)為差異基因的顯著性(-log10(P VALUE));橙色點(diǎn)即為篩選出的差異基因.(彩圖見電子版：http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx.(2019年第1期)).

圖2 GO分析Fig.2 GO analysis

圖3 通路富集網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Pathway analysis

注：圖中圓點(diǎn)表示Pathway，大小代表degree值；顏色表示上下調(diào)(藍(lán)色表示下調(diào)，黃色表示既有上調(diào)也有下調(diào)；)；箭頭表示上下游.

2.4 共表達(dá)分析

通過基因共表達(dá)分析，進(jìn)一步揭示了差異基因表達(dá)值相關(guān)關(guān)系，并從中找到了可能的核心基因，基因CCNB1 、NUSAP1、KIF11、BUB1、BUB1B、OIP5、SHCBP1、ZWINT、FANCI、TOP2A、DLGAP5、CDKN3、NCAPG、FEN1、CCNB2等有望成為潛在的靶點(diǎn)。(見圖4)

圖4 共表達(dá)分析Fig.4 Co-expression analysis

注：圖中圓點(diǎn)表示基因，大小代表degree值；顏色表示上下調(diào)(紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào))；實(shí)線表示正相關(guān)，虛線表示負(fù)相關(guān).

2.5 差異基因信號網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫，基因之間具有上、下游激活、抑制等調(diào)控關(guān)系，差異基因信號網(wǎng)絡(luò)綜合分析旨在探討差異基因的上下游調(diào)控關(guān)系，從中發(fā)現(xiàn)潛在的關(guān)鍵基因，通過網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)PLCB1、PIK3R1、PIK3CA、STAT3、EP300、CAMK2D、PRKCB、CREB1、ANAPC5、CDC27等基因位于網(wǎng)絡(luò)核心部位，有望成為新的生物標(biāo)記(見圖5)。

圖5 基因信號網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Gene signal network

注：圖中圓點(diǎn)表示基因；大小代表betweenness centrality值；顏色表示上下調(diào)(藍(lán)色表示下調(diào))；箭頭表示上下游，虛線表示間接作用.

3 討 論

本研究通過分析了膿毒癥休克與SIRS各29個樣本，有1 456個基因被識別為差異基因(P<0.05)，與SIRS組相比，膿毒癥休克組中有條859條下調(diào)基因、597條上調(diào)基因。

將篩選出來的基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析，結(jié)果顯示差異基因主要是富集于與細(xì)胞周期、細(xì)胞有絲分裂有關(guān)的功能模塊中，這表明膿毒癥休克期機(jī)體的代謝處于一個異常活躍的狀態(tài)，這也與膿毒癥機(jī)體炎性反應(yīng)爆發(fā)、失調(diào)相符合。GO功能分析以及pathway分析都顯示了，差異基因與細(xì)胞凋亡進(jìn)程有關(guān)，研究證實(shí)免疫細(xì)胞的凋亡在促進(jìn)了膿毒癥患者免疫功能的衰竭通是也促進(jìn)了器官功能障礙的進(jìn)程[10]。

CCNB1、CCNB2、TOP2A共同處于基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的核心位置，且研究證實(shí)它們參與了ARDS的發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，是ARDS診治過程中的核心基因，同時在本研究中，這些基因可能參與了膿毒癥休克的主要進(jìn)程[11]。

通過KEGG基因信號網(wǎng)絡(luò)分析，從構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)模塊中篩選出了處于網(wǎng)絡(luò)核心部位的一些基因，stat3(信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3)這種蛋白是受到細(xì)胞因子和生長因子(IFNs,、EGF、 IL5、 IL6,、HGF、 LIF 、BMP)而磷酸化激活的，它介導(dǎo)了細(xì)胞對于刺激時許多基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞生長和凋亡等許多細(xì)胞過程中起關(guān)鍵作用。膿毒癥是由感染誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)STAT3激活可以減弱系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)和膿毒癥的致死性，部分通過抑制免疫細(xì)胞過度活化，表明STAT3在維持宿主動態(tài)平衡中的關(guān)鍵作用[12]。

EP300(別名：KAT3B, RSTS2,p300)通過染色質(zhì)重塑調(diào)控轉(zhuǎn)錄的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，在細(xì)胞增殖和分化過程中起重要作用，并通過與磷酸化CREB蛋白結(jié)合而介導(dǎo)cAMP基因的調(diào)節(jié)。先前的研究也已經(jīng)證實(shí)P300與膿毒癥中骨骼肌代謝，肌細(xì)胞流失有一定的相關(guān)性[13]。而基因NUSAP1、KIF11、BUB1、BUB1B、、PLCB1、PIK3R1、PIK3CA、CAMK2D、PRKCB、CREB1、ANAPC5是通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選出來的相關(guān)的潛在基因，或許可以提供新的研究方向。

4 結(jié) 論

通過基因芯片技術(shù)，找到疾病相關(guān)基因，并使用生物科學(xué)技術(shù)和高通道篩選技術(shù)找到差異基因，可以更好的了解小兒膿毒癥休克與SIRS之間的差異，從中篩選出可能的潛在基因，為進(jìn)一步的預(yù)防和治療策略的探索提供可能的研究方向，但需要進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。