活性維生素D3對阿霉素腎病大鼠CD2AP的影響

陳亞茹，趙丹，楊曉萍，羅星，劉馨馨，馬國英

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）是以腎功能損害、蛋白尿排泄率升高為主要特征的臨床常見疾病[1]。近年來，隨著對CKD尿蛋白分子機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)腎足細(xì)胞表面維生素D受體是活性維生素D3發(fā)揮抗蛋白尿的重要靶點[2]。CD2相關(guān)蛋白（CD2AP），作為足細(xì)胞標(biāo)志分子，具有維持細(xì)胞良好形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能[3]。本實驗研究骨化三醇對阿霉素（Adriamyicin,ADR）腎病大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)的影響，探討活性維生素D3的腎保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

90只6周齡雄性SPF級健康Sprasue-Dawley大鼠，體重（200±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2013-0001。

1.2 實驗試劑及儀器

1.2.1 主要試劑ADR（深圳萬樂藥業(yè)有限公司，批號：1409E1），骨化三醇（上海羅氏制藥有限公司，批號：J20150011），CD2AP兔多克隆抗體（美國Bioworld Technology公司），GAPDH鼠單抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），蛋白預(yù)染Marker 26616（美國Thermo Fisher Scientific公司），免疫組織化學(xué)染色二步法檢測試劑盒（北京中杉橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2.2 實驗儀器全自動生化分析儀BC6800（深圳邁瑞醫(yī)療國際有限公司），透射電子顯微鏡（日本Olympus Optical公司），電泳及電轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司），Gel Doc 2000凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 動物模型的復(fù)制及分組

采用隨機數(shù)字表法將60只大鼠經(jīng)單次尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg復(fù)制模型，另取30只為對照組。2周后，3組隨機選取6只大鼠檢測24 h尿蛋白、血清總蛋白（total protein,TP）、血漿白蛋白（plasma albumin,ALB）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、血清肌酐（serum creatinine，Scr）水平，判斷模型是否復(fù)制成功。將模型復(fù)制成功的SD大鼠隨機均分為模型組和治療組。治療組給予0.25μg/（kg·d）骨化三醇灌胃治療，對照組、模型組給予等量花生油灌胃。模型復(fù)制成功后每2周每組取6只大鼠檢測24 h尿蛋白，取腎組織冷凍保存。第10周實驗結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 尿蛋白、血生化檢測治療2、4、6、8和 10周后代謝籠留24 h尿，檢測24 h尿蛋白。經(jīng)大鼠腹主動脈采血，用全自動生化分析儀檢測TP、ALB、TC、Scr水平。

1.4.2 Masson染色將4μm厚的大鼠腎組織石蠟切片梯度酒精脫蠟、脫二甲苯處理。經(jīng)核染液染色60 s，漿染液染色30～60 s，黃色分色液分色6～8 min，直接用苯藍(lán)/光綠液復(fù)染5 min左右，梯度酒精脫水，晾干，中性樹膠封片。

1.4.3 透射電子顯微鏡實驗結(jié)束時，各組隨機選取 3只大鼠取其新鮮腎皮質(zhì)約1 mm×1 mm×1 mm，經(jīng)2.5%戊二醛初固定，1%鋨酸再固定，脫水、包埋、半薄切片、定位修塊，超薄切片機制成50～60 nm的超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，封片、鏡檢、攝像。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色將4μm厚的腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、微波高溫抗原修復(fù)，3%過氧化氫內(nèi)源性過氧化物酶封閉，滴加CD2AP（1∶400）4℃孵育過夜，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)二抗，PBS漂洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明，封片。每張切片隨機選取5個腎小球視野，根據(jù)腎小球和腎小管間質(zhì)單位內(nèi)陽性信號面積與總面積的比值，計算CD2AP表達(dá)水平。

1.4.5 Western blotting檢 測從-80℃冰 箱 取 出100 mg腎組織，加1 ml裂解液研磨（裂解液在使用前按1∶100比例加入10μl PMSF），所有操作在冰上進(jìn)行。研磨充分，取上清用BCA法測定蛋白濃度，配平。加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮8 min，上樣量50μg/孔。SDS-PAGE電泳濃縮膠：83 V，30 min；分離膠：100 V，1 h；電轉(zhuǎn)：23 V，100 min；5%脫脂奶粉封閉2 h，滴加一抗（CD2AP 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗，CD2AP山羊抗兔二抗（1∶5 000）和GAPDH山羊抗小鼠二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗二抗，用ECL發(fā)光試劑暗室曝光，Image Lab系統(tǒng)圖像攝取，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

注射ADR后2周，模型組與對照組2周后大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組TP、ALB低于對照組，24 h尿蛋白、Scr、TC高于對照組，提示模型復(fù)制成功（見表1）。對照組大鼠被毛有光澤，精神狀況良好，作息較規(guī)律；模型組毛皮暗淡無光，易嗜睡，反應(yīng)遲緩，飲食欠佳；治療組較模型組飲食、精神狀態(tài)均有不同程度改善。

2.2 各組大鼠的24 h尿蛋白比較

實驗前，3組大鼠24 h尿蛋白比較，經(jīng)單因素方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.369，P=0.697），具有可比性。對照組、模型組、治療組大鼠活性維生素D3治療2、4、6、8和10周后24 h尿蛋白比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的24 h尿蛋白有差別（F=566.288，P=0.000）。②3組大鼠24 h尿蛋白有差別（F=6 679.977，P=0.000）；模型組較對照組升高，活性維生素D3治療后24 h尿蛋白水平降低。③3組大鼠24 h尿蛋白變化趨勢有差別（F=843.349，P=0.000）。見表2和圖1。

2.3 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎組織病理學(xué)改變的影響

Masson染色結(jié)果顯示，對照組大鼠腎小球及腎小管基底膜的膠原成分被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，僅少量膠原分布，腎組織其他部分未見明顯膠原沉積。模型組大鼠的腎小球和腎小管基底膜增厚，腎間質(zhì)中染成藍(lán)色的膠原纖維增多，并出現(xiàn)片狀淡藍(lán)色纖維樣壞死。治療組大鼠腎間質(zhì)膠原纖維增生減輕，第10周末治療效果明顯，提示活性維生素D3能減輕腎小球結(jié)構(gòu)的損傷。見圖2。

表1 3組大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較（n=6，±s）

表1 3組大鼠24 h尿蛋白和血生化檢測結(jié)果比較（n=6，±s）

組別 24 h尿蛋白/mg TP/（g/L） ALB/（g/L） Scr/（μmol/L） TC/（mmol/L）對照組 7.353±0.370 63.273±3.951 33.530±1.922 26.855±0.761 1.603±0.226模型組 33.269±2.598 44.948±6.510 21.878±3.014 57.649±4.893 3.228±0.220 t值 5.562 5.390 3.935 6.307 1.027 P值 0.004 0.043 0.037 0.031 0.001

表2 3組大鼠不同時間點的24 h尿蛋白比較（n=30，mg，±s）

表2 3組大鼠不同時間點的24 h尿蛋白比較（n=30，mg，±s）

組別 2周 4周 6周 8周 10周對照組 6.430±0.145 8.763±0.095 8.530±0.146 9.387±0.184 9.967±0.154模型組 33.233±0.963 39.390±0.224 42.983±0.845 66.063±0.723 79.163±0.563治療組 29.850±0.130 30.083±0.219 27.490±0.341 25.998±0.459 21.153±0.323

圖1 3組大鼠24 h尿蛋白變化趨勢（n=30，±s）

2.4 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

大鼠腎組織透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，對照組大鼠足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，基底膜平滑均勻無增厚，釘突狀足突清晰可見，向外延伸，彼此連接，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則。模型組大鼠足細(xì)胞足突回縮，熔蠟般廣泛融合，細(xì)胞核畸形且胞內(nèi)有脂滴聚集。活性維生素D3治療后，足細(xì)胞損傷減輕，細(xì)胞核形態(tài)良好，足突完整，偶見融合與少量的脂滴凝集。見圖3。

圖2 3組大鼠腎組織病理學(xué)改變（Masson染色×400）

圖3 3組大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變（透射電子顯微鏡）

2.5 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎小球CD2AP分布的影響

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可以看出CD2AP主要定位于腎小球的足細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈黃褐色或淡黃色片狀分布。CD2AP蛋白在對照組、模型組、治療組的相對表達(dá)量分別為（0.094±0.002）、（0.041±0.014）和（0.080±0.019），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.802，P=0.000）；治療組CD2AP蛋白表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05），可見活性維生素D3可抑制ADR誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞CD2AP表達(dá)降低，上調(diào)腎足細(xì)胞CD2AP的表達(dá)，伴隨尿蛋白減少。見 圖4。

圖4 ADR腎病大鼠腎組織CD2AP蛋白的表達(dá)（IHC×400）

2.6 活性維生素D3對ADR腎病大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)的影響

對照組、模型組、治療組大鼠2、6和10周的腎小球CD2AP蛋白相對表達(dá)量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=111.181，P=0.000）。②3組大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4613.574，P=0.000），治療組高于對照組和模型組。③3組大鼠腎小球CD2AP蛋白表達(dá)水平變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=95.446，P=0.000）。見表3和 圖5。

表3 3組大鼠不同時間點CD2AP蛋白表達(dá)水平比較（n=30，±s）

表3 3組大鼠不同時間點CD2AP蛋白表達(dá)水平比較（n=30，±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 2周 6周 10周對照組 0.854±0.105 0.864±0.201 0.896±0.067模型組 0.352±0.1501） 0.336±0.1241） 0.306±0.0171）治療組 0.490±0.0911）2） 0.510±0.2281）2） 0.734±0.0831）2）

圖5 3組大鼠CD2AP蛋白表達(dá)水平的變化趨勢（n=30，±s）

3 討論

腎小球疾病仍然是慢性和終末期腎病的主要原因。通過對動物模型的研究，學(xué)者對人類腎小球疾病的認(rèn)識取得了重大進(jìn)展[4]。絕大多數(shù)CKD為腎小球上皮細(xì)胞的疾病。在科研實驗中，嚙齒動物能更好地誘導(dǎo)疾病，以利于研究其進(jìn)展機制，確定潛在的目標(biāo)和治療方法[5]。本實驗根據(jù)文獻(xiàn)報道，通過一次性尾靜脈注射ADR 7.5 mg/kg獲得非糖尿病足細(xì)胞疾病的動物模型，即ADR腎病模型[6]。2周末檢測24 h蛋白尿、血生化指標(biāo)顯示，與對照組比較，模型組24 h尿蛋白升高，血清TP、ALB下降，Scr、TC升高；且2周末大鼠精神狀態(tài)欠佳，反射遲鈍，飲食量減少，提示模型復(fù)制成功。

足細(xì)胞損傷，突變或丟失都是足細(xì)胞復(fù)雜結(jié)構(gòu)的物理改變，一旦足細(xì)胞足突扁平或抹失，腎小球的濾過屏障就不再完整，血管中的蛋白質(zhì)泄漏至尿液中，就產(chǎn)生了蛋白尿[7]。蛋白尿是腎功能障礙重要的臨床標(biāo)志。

維生素D最活躍的代謝物是1，25-二羥維生素D，其是礦物體內(nèi)平衡的中樞調(diào)節(jié)劑，對骨骼健康和礦物代謝至關(guān)重要[8]。也有研究證實在結(jié)腸直腸癌中，活性維生素D3能夠抑制增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌上皮分化[5]。目前，關(guān)于CKD的研究熱點是活性維生素D3如何減輕腎足細(xì)胞損傷，改善CKD的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，在嘌呤霉素氨基核苷腎病、ADR腎病、糖尿病腎病模型鼠中普遍存在維生素D的缺乏，給予 活性維生素D3可以減輕腎組織損傷，顯著減少蛋白尿的產(chǎn)生[9-11]，與本研究結(jié)果有高度一致性[9-11]。筆者用ADR誘導(dǎo)的CKD模型腎組織損傷嚴(yán)重，Masson染色可見大量藍(lán)染的膠原纖維增生，腎小管間質(zhì)內(nèi)可見腎小管擴張和腎間質(zhì)纖維化。但腎臟纖維化是否與CD2AP蛋白密切相關(guān)，目前尚沒有報道。

CD2AP是足細(xì)胞裂孔隔膜特異表達(dá)的蛋白，能維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，CD2AP表達(dá)異常在蛋白尿的發(fā)生機制中發(fā)揮重要的作用。RUSSO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD2AP基因敲除的小鼠，腎小球上皮細(xì)胞足突缺陷產(chǎn)生蛋白尿，最終腎衰竭而死。本研究發(fā)現(xiàn)，ADR腎病大鼠腎組織損傷嚴(yán)重，超微結(jié)構(gòu)顯示腎足細(xì)胞核畸形，足突融合，脂滴形成，CD2AP表達(dá)明顯降低，這表明CD2AP表達(dá)降低是引起腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷的重要原因，進(jìn)一步破環(huán)腎小球濾過屏障，導(dǎo)致濾過膜通透性增強，產(chǎn)生蛋白尿?；钚跃S生素D3治療后，CD2AP表達(dá)增強，大鼠24 h尿蛋白降低，腎組織纖維化癥狀減輕，足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示胞核規(guī)則，胞膜光滑無增厚，足突清晰可見。

本研究通過復(fù)制ADR腎病模型，證明ADR能夠誘導(dǎo)腎小球損傷，包括腎小球結(jié)構(gòu)病理改變及足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，這些損傷參與慢性腎病蛋白尿的產(chǎn)生過程?；钚跃S生素D3能夠上調(diào)CD2AP表達(dá)，改善腎足細(xì)胞損傷，維持腎小球濾過膜的完整性，減少了蛋白尿的產(chǎn)生，發(fā)揮腎功能保護(hù)作用。近年來，眾多學(xué)者對足細(xì)胞病、蛋白尿的分子機制和信號通路研究多集中在足細(xì)胞特異分子Nephrin引導(dǎo)的信號通路，而CD2AP獨立于其他分子的功能研究相對較少[13]。本研究證明CD2AP在活性維生素D3治療慢性腎病，減少蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展機制中承擔(dān)重要的角色。目前，關(guān)于CD2AP的具體分子機制尚不完善，有待研究者多維度深入探討。