CREB1對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能障礙的 影響及機(jī)制研究*

方玲，楊莉莉

（1.杭州市第七人民醫(yī)院 精神三科，浙江 杭州 310013；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230601）

隨著血管性癡呆發(fā)病率的不斷升高，探討血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制可為血管性癡呆的防治提供依據(jù)[1]。環(huán)腺苷酸反應(yīng)成分結(jié)合蛋白1（cyclic adenylate response component binding protein 1,CREB1）在血管內(nèi)皮化和血管內(nèi)膜形成中具有重要作用[2]；在神經(jīng)元應(yīng)激性損傷后的修復(fù)、再生及存活中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CREB1在抑郁癥患者中水平下降[3]。本文探討CREB1在血管性癡呆大鼠海馬組織中的表達(dá)，以及對(duì)認(rèn)知功能的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康、清潔級(jí)、雌雄各半、體重270～290 g的SD大鼠40只[中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，許可證號(hào)：SYXK（京）2014-0032]。

1.1.2 主要試劑CREB1過表達(dá)慢病毒載體和空載體病毒（美國(guó)Promega公司），兔抗大鼠CREB1多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Bax多克隆抗體、兔抗鼠磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-PKB）多克隆抗體、兔抗鼠蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）多克隆抗體、過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G及激動(dòng)蛋白β（β-actin）抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及血管性癡呆模型的復(fù)制將40只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（假手術(shù)組）、模型組（血管性癡呆組）、陰性對(duì)照組（血管性癡呆+空載體病毒處理組）及CREB1過表達(dá)組（血管性癡呆+CREB1過表達(dá)病毒處理組），每組10只。采用四血管阻斷法復(fù)制血管性癡呆模型[4]：將大鼠用水合氯醛麻醉成功后，在枕骨下做長(zhǎng)1 cm水平切口，暴露大鼠第1頸椎和第1頸椎兩側(cè)橫突翼孔，用電凝針燒灼兩側(cè)椎動(dòng)脈，造成椎動(dòng)脈永久性閉塞，縫合切口。24 h后水合氯醛麻醉大鼠，組織剪剪開頸正中線長(zhǎng)約1 cm切口，分離結(jié)締組織，找到頸總動(dòng)脈，微血管夾夾閉頸總動(dòng)脈15 min，再通10 min，共3次，縫合切口。對(duì)照組僅暴露血管，不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉。

1.2.2 大鼠處理4組大鼠模型復(fù)制成功后2 d，采用腦立體定位注射病毒載體[5]：4組大鼠水合氯醛麻醉成功后，固定到腦立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒后，沿矢狀縫剪開頭部皮膚，以矢狀縫和人字縫交點(diǎn)為原點(diǎn)，按照腦立體定位儀圖譜，鉆開顱骨，垂直腦表面進(jìn)針，CREB1過表達(dá)組大鼠5 min內(nèi)緩慢注入2.5μl CREB1過表達(dá)載體病毒；陰性對(duì)照組大鼠5 min內(nèi)緩慢注入等量空載體病毒；模型組和對(duì)照組5 min內(nèi)緩慢注入等量生理鹽水。緩慢退針，縫合皮膚。

1.2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)4組大鼠處理后第2天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，將直徑100 cm、高50 cm水池分成4個(gè) 象限，將圓柱形平臺(tái)放入水池中，實(shí)驗(yàn)前將水池注水至淹沒水池平臺(tái)2 cm，水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行試驗(yàn)（共4 d）和空間探索試驗(yàn)（第5天進(jìn)行）。定位航行試驗(yàn)：將水池中注水至高出平臺(tái)2 cm，水溫保持約25℃，將大鼠依次從各個(gè)象限放入水中進(jìn)行訓(xùn)練，每只大鼠每天上、下午分別訓(xùn)練4次，1次/象限，8次/d，訓(xùn)練2 min/次，大鼠找到平臺(tái)并在平臺(tái)上停留30 s。如2 min內(nèi)沒有找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其找到平臺(tái)并停留30 s，然后休息2 min再進(jìn)行下一次訓(xùn)練。大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間為逃避潛伏期，取每只大鼠訓(xùn)練的平均值?？臻g探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束后將水池中平臺(tái)去除，次日進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，將大鼠放入水中，記錄大鼠穿越原平臺(tái)象限 次數(shù)。

1.2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)取一個(gè)長(zhǎng)47 cm×47 cm×40 cm的曠場(chǎng)，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠放入曠場(chǎng)中心方格內(nèi)，在曠場(chǎng)上方安置攝像機(jī)，記錄大鼠運(yùn)動(dòng)情況，記錄15 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)次數(shù)和活動(dòng)距離。

1.2.5 大鼠海馬組織CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平測(cè)定曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭，冰上取出大鼠腦組織海馬組織。采用Western blotting檢測(cè)大鼠海馬組織CREB1、Caspase-3、Bcl-2、Bax、PI3K、p-PKB及PKB蛋白水平：取大鼠海馬組織加入RIPA裂解液，勻漿后提取海馬組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)電泳、切膠及轉(zhuǎn)膜，加入一抗（1∶1 000）過夜孵育，加入二抗孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參照（1∶2 000），ECL發(fā)光液顯影。采用NIH1162軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）分析各蛋白條帶光密度值，目標(biāo)蛋白水平為目標(biāo)蛋白條帶光密度值/β-actin條帶光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)次數(shù)高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)距離比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)距離短于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)距離長(zhǎng)于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）

表1 4組大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）

組別 活動(dòng)次數(shù)（次/15 min）活動(dòng)距離（m/15 min）對(duì)照組 223.42±25.46 12.14±1.15模型組 94.35±22.74 3.15±0.97陰性對(duì)照組 96.57±23.04 3.32±1.04 CREB1過表達(dá)組 165.26±24.37 7.58±1.13 F值 66.787 156.651 P值 0.000 0.000

2.2 4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠逃避潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠逃避潛伏期短于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越原平臺(tái)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù)高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）

表2 4組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=10，±s）

?

2.3 4組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平比較

對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組CREB1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.78±0.11）、（0.11±0.03）、（0.15±0.04）和（0.42±0.08），經(jīng) 方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=181.905，P=0.000）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織CREB1蛋白水平高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見圖1。

2.4 4組大鼠海馬組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較

圖1 4組大鼠海馬組織CREB1蛋白的表達(dá)

4組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Caspase-3蛋白水平低于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織Bax蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平高于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白水平低于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。見表3和圖2。

表3 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較（n=10，±s）

表3 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白水平比較（n=10，±s）

組別 Caspase-3蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白對(duì)照組 0.15±0.05 0.94±0.12 0.12±0.04模型組 0.83±0.09 0.31±0.08 0.51±0.07陰性對(duì)照組 0.85±0.11 0.33±0.09 0.54±0.06 CREB1過表達(dá)組 0.27±0.08 0.77±0.10 0.24±0.07 F值 185.246 103.128 112.600 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 4組大鼠海馬組織Caspase-3、Bcl-2 及Bax蛋白的表達(dá)

2.5 4組大鼠海馬組織PI3K/PKB通路蛋白水平比較

4組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織PI3K蛋白水平高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組、陰性對(duì)照組及CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05），CREB1過表達(dá)組大鼠海馬組織p-PKB蛋白水平高于模型組和陰性對(duì)照組（P＜0.05）。4組大鼠海馬組織PKB蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和 圖3。

表4 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB及PKB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

表4 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB及PKB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，±s）

組別 PI3K蛋白 p-PKB蛋白 PKB蛋白對(duì)照組 0.67±0.09 0.57±0.08 0.63±0.10模型組 0.13±0.04 0.15±0.05 0.59±0.11陰性對(duì)照組 0.16±0.05 0.18±0.06 0.64±0.09 CREB1過表達(dá)組 0.38±0.07 0.42±0.08 0.67±0.11 F值 145.731 85.079 1.032 P值 0.000 0.000 0.390

圖3 4組大鼠海馬組織PI3K、p-PKB 及PKB蛋白的表達(dá)

3 討論

血管性癡呆是繼阿爾茨海默病之后與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)功能障礙性疾病。其主要由缺血性腦血管疾病所致的腦組織局部腦血流量減少、缺氧及局部缺氧等所造成的腦血管疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙。通過抑制血管性因素、改善腦血管損傷等均可減輕血管性癡呆的認(rèn)知功能障礙癥狀[6]。血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，細(xì)胞凋亡在血管性癡呆的發(fā)病中具有重要作用。細(xì)胞凋亡是生物界一種基本的生物學(xué)顯效，與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡指在病理因素或者外界生理因素的作用下，啟動(dòng)程序基因，細(xì)胞按照一定的程序控制出現(xiàn)自我死亡[7]。細(xì)胞凋亡是缺血、缺氧所致神經(jīng)元損傷的一種形式，與多種腦血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切。在血管性癡呆的研究中，細(xì)胞凋亡也越來越受到重視，大腦海馬CA1區(qū)對(duì)缺血、缺氧很敏感，是海馬組織中與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的功能區(qū)，海馬神經(jīng)元的存活數(shù)量直接影響海馬神經(jīng)元對(duì)信息的貯存和處理[8]。研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元大量凋亡丟失，海馬神經(jīng)元的凋亡丟失是血管性癡呆發(fā)病的病理基礎(chǔ)之一[9]。

本文通過復(fù)制血管性癡呆大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)海馬是與認(rèn)知功能關(guān)系密切的解剖學(xué)部位，水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)認(rèn)知功能的常用方法。Caspase-3、Bcl-2及Bax是目前最受關(guān)注的凋亡調(diào)控基因，Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的凋亡執(zhí)行蛋白酶，其激活依賴Cyc-c的釋放[10]；Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控基因，可通過線粒體途徑導(dǎo)致Cyc-c物質(zhì)的釋放，從而激活Caspase-3，執(zhí)行細(xì)胞凋亡。Bcl-2、Bax不僅可作為Caspase-3的上游調(diào)控基因，而且參與調(diào)節(jié)Caspase-3活性；可作為Caspase-3底物對(duì)Caspase-3下游發(fā)揮作用，Bcl-2/Bax可反映細(xì)胞的凋亡傾向，Caspase-3、Bcl-2及Bax在細(xì)胞凋亡中相互影響、相互制約[11]。PI3K蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種功能，PI3K由1個(gè)催化壓積和1個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成，為異源二聚體[12]；PKB為其下游重要信號(hào)通路，PI3K被激活后可以產(chǎn)生第二信使磷脂酰肌-醇-3，4，5-三磷酸；其磷酸化PKB蛋白的Ser308，導(dǎo)致PKB磷酸化，磷酸化的PKB通過下游因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等過程[13]。本研究結(jié)果表明，血管性癡呆模型大鼠存在認(rèn)知功能障礙，其發(fā)生機(jī)制可能與血管性癡呆大鼠腦組織缺血、缺氧，造成海馬組織通過PI3K/p-PKB通路促進(jìn)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而引起海馬神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。

本文對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組CREB1水平進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CREB與記憶關(guān)系密切，在大腦神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)時(shí)，CREB可幫助激活一些與長(zhǎng)期記憶形成關(guān)系密切的基因，從而有利于長(zhǎng)期記憶的形成。研究發(fā)現(xiàn)，記憶力強(qiáng)的大鼠CREB處于活躍狀態(tài)[14-15]。CREB1位于2q32～q34染色體上，為CREB編碼基因，具有促進(jìn)血管形成，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等多種功能[16-17]。CREB1在腦缺血性疾病中具有腦保護(hù)作用[18]。抑郁癥大鼠海馬等腦區(qū)CREB1水平下降，其可能參與調(diào)控抑郁癥的發(fā)病過程[19-20]。本研究結(jié)果表明，CREB1可能參與CREB1的發(fā)病過程，過表達(dá)CREB1可能通過激活PI3K/PKB信號(hào)通路，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，改善大鼠的認(rèn)知功能障礙狀態(tài)。

綜上所述，CREB1可能通過PI3K/PKB通路抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善血管性癡呆的認(rèn)知功能障礙，CREB1有望成為血管性癡呆預(yù)防和治療的潛在靶點(diǎn)。