過表達(dá) CKLF1 基因?qū)?qiáng)直性脊柱炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖及成骨轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗(yàn)研究

李虎 李儒軍 陶可 趙丹 張立毅 高嘉翔 柯巖 林劍浩

作者單位：100044 北京大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科、關(guān)節(jié)炎診療中心(李虎、李儒軍、陶可、張立毅、高嘉翔、柯巖、林劍 浩)；100871 北京大學(xué)工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系(趙丹)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondyliti，AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)炎、肌腱端炎和脊柱炎為特點(diǎn)的慢性進(jìn)行性全身結(jié)締組織疾病，是其它脊柱關(guān)節(jié)病(spondyloarthritis，SpA)的原型。AS 好發(fā)于青壯年男性，國內(nèi) AS 發(fā)病率為 0.23%。由于本病病因尚未完全明確，起病隱匿，病程遷延，早期臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性，晚期病情嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)脊柱強(qiáng)直、關(guān)節(jié)畸形后，病情不能扭轉(zhuǎn)，可導(dǎo)致功能喪失，是青壯年致殘的主要原因。以往研究證實(shí)肌腱附著點(diǎn)異常骨化是其病變基礎(chǔ)，而成纖維細(xì)胞在致炎性因子作用下的成骨轉(zhuǎn)化在 AS 病理性骨化鈣化發(fā)病、進(jìn)展過程中起重要作用[1-6]。

趨化素樣因子 1(chemokine-like factor1，CKLF1)是北京大學(xué)人類基因研究中心利用差異性遞減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization，SSH)，在國際上克隆 U937 細(xì)胞中被植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激并被白細(xì)胞介素(IL)-10 抑制的 cDNA 中，首次發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，具有 CC 家族趨化因子的結(jié)構(gòu)特征和功能特征[7]。體內(nèi)外的研究均證實(shí)，CKLF1 可以明顯激活并趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞[7]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)[8]，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatic arthritis，RA)滑膜中 CKLF1 表達(dá)水平明顯高于骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和半月板損傷的 CKLF1 水平，提示其在 RA 發(fā)病中可能起到重要作用。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)[9]，AS 患者髖關(guān)節(jié)囊滑膜組織中 CKLF1 及其受體 CCR4 表達(dá)明顯升高，且與體內(nèi) C 反應(yīng)蛋白、血沉和 D-二聚體等水平存在一定正相關(guān)性，表明 CKLF1 在 AS 病變中可能也發(fā)揮重要作用。最新研究還發(fā)現(xiàn)[10]，CKLF1 基因過表達(dá)能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)囊周圍滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和致炎性細(xì)胞因子分泌，并增強(qiáng)成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，推測(cè) CKLF1 可能在 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討 CKLF1 對(duì) AS 髖關(guān)節(jié)囊另一種參與病理性骨性強(qiáng)直的重要的細(xì)胞成分即滑膜成纖維細(xì)胞的增殖和向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，以明確其在 AS 發(fā)病過程中的可能作用機(jī)制并為探尋 AS 新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

DMEM 培養(yǎng)液、Opti-MEMTM、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶＋0.02% EDTA、磷酸鹽緩沖液(PBS)等試劑均購于 Gibco 公司，pCDI-CKLF1 和兔抗人 CKLF1 多克隆抗體(北京大學(xué)人類疾病基因研究中心韓文玲、陳英玉和馬大龍教授饋贈(zèng))，人胚胎腎 293T 細(xì)胞、AAV-2 質(zhì)粒(pACP)、Ad5 和 Ad8 腺病毒等為本實(shí)驗(yàn)室保存，II 型膠原酶、HEPES(Sigma 公司)，限制性內(nèi)切酶 Xbal、BamHl、EcoRI 和 T4 DNA 連接酶等(Rothe 公司)，WST-1 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Rothe 公司)，白細(xì)胞介素(IL)-6 和腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(RD 公司)，一抗(除 CKLF1 外)均來自于 Abcam 公司，H & E 染液(Rothe 公司)，Trizol 細(xì)胞裂解液(Invitrogen 公司)，熒光定量 RT-PCR(fluorescence quantitative RT-PCR，F(xiàn)Q-PCR)試劑盒(Invitrogen 公司)，Rhodamine 標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(Sigma 公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 公司)，F(xiàn)Q-PCR 反應(yīng)儀(ABI 公司)，激光共聚焦顯微鏡(Confocal，Olympus 公司)。

二、倫理審批

本研究經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)遞交倫理審查批準(zhǔn)所有參與的患者均簽署知情同意書。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均嚴(yán)格遵從赫爾辛基宣言等，保護(hù)受試者權(quán)益；實(shí)驗(yàn)后，嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)室生化試劑使用后的無害化處理原則及按照醫(yī)院醫(yī)療廢物處理規(guī)章制度處理實(shí)驗(yàn)用標(biāo)本。

三、髖關(guān)節(jié)滑膜組織的獲取

本實(shí)驗(yàn)所需正常和 AS 人髖關(guān)節(jié)滑膜組織分別取自于我科 4 例臨床診斷為股骨頸骨折 [排除 OA、RA 和 AS 等疾病，平均年齡：( 63.75±3.49)歲，男] 和 3 例重度 AS(髖關(guān)節(jié)強(qiáng)直)[11][排除 OA、RA 等疾病，平均年齡：( 46.00±2.94)歲，男] 擬行髖關(guān)節(jié)置換的患者，兩組患者人口學(xué)資料相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

滑膜成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參考已建立的方法[9-10]。具體如下：無菌操作條件下，取新鮮獲取的髖關(guān)節(jié)囊周圍滑膜組織，PBS 沖洗至液體無色透明，眼科剪剔除周圍脂肪組織，剪碎后用 1 mg / ml II 型膠原酶消化過夜，離心去上清，加入 10% 胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基(含青霉素和鏈霉素)重懸單細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞及存活率(＞95%)，分裝于 75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)后 24 h 首次更換培養(yǎng)基并去除未貼壁的細(xì)胞，以后每隔 3 天換液 1 次。采用倒置相差顯微鏡每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)用第 3～5 代細(xì)胞[12]。取上述第 3 代細(xì)胞，以 1×105/ 每孔接種于預(yù)置有蓋玻片(24 mm × 24 mm，經(jīng)多聚賴氨酸 / 甘油處理)的 6 孔板中，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。4% 的多聚甲醛固定后，依次經(jīng)過 0.25% Triton X-100 通透化、3% 的 BSA 封閉、抗 vimentin 抗體 4 ℃ 過夜和 Rhodamine 標(biāo)記的熒光二抗孵育后，將玻片置于 Confocal 顯微鏡下觀察、拍照分析。

五、髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位和成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的構(gòu)建

首先，髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位培養(yǎng)：按照已報(bào)道的髖關(guān)節(jié)滑膜組織原位培養(yǎng)模型[10]并借鑒 Riera 等[13]報(bào)道的人半月板原位培養(yǎng)模型進(jìn)行髖關(guān)節(jié)滑膜組織取材。具體方法為：采用直徑 2 mm 特制取材器對(duì)新鮮髖關(guān)節(jié)囊內(nèi)滑膜組織進(jìn)行打孔取材，后將圓柱狀標(biāo)本(長(zhǎng) 4 mm，直徑 2 mm)置入 24 孔板中并加入 10% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。其次，建立滑膜成纖維細(xì)胞體外(in vitro)2D 培養(yǎng)模型[9-10]：將上述經(jīng)鑒定的滑膜成纖維細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)后分別接種于 96 孔板(1×104/ 每孔)、預(yù)置有蓋玻片的 6 孔板和 75 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行 2D 平面培養(yǎng)。每 3 天更換 1 次組織和細(xì)胞的培養(yǎng)基。

六、重組腺相關(guān)病毒(rAAV)-hCKLF1 載體的包裝與鑒定 [7,10,14-17]

首先，RT-PCR 獲取和擴(kuò)增人 CKLF1 cDNA；同時(shí)，pCDI-CKLF1 擴(kuò)增后進(jìn)行過夜(18 h)酶切(EcoRI 限制性內(nèi)切酶)和 0.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切情況。利用 DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，檢測(cè)分光光度值(OD 值)標(biāo)記濃度，比較兩種方法所得 CKLF1 基因一致性。其次，使用 T4 DNA 連接酶，將 CKLF1 基因插入表達(dá)載體 pACP(來源于 pSSV9，是 AAV-2 基因克隆之一)[14-16]，具體為：4 μl 純化 CKLF1 基因產(chǎn)物，1.6 μl 已酶切暴露黏性末端的表達(dá)載體 pACP，0.5 μl T4 DNA 連接酶，1.9 μl 10×ligation buffer，終體積 8 μl。16 ℃ 水浴過夜鏈接，70 ℃ 5 min 終止鏈接反應(yīng)，備用。再次，取 2 μl 上述反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，最后涂在含有 100 mg / ml 青霉素的 LB 平板上進(jìn)行篩選，平板置于 37 ℃ 孵箱過夜，觀察陽性克隆。無菌條件下，挑取單個(gè)陽性克隆菌落加入含 100 mg / ml 青霉素的 LB 培養(yǎng)基 5 ml 中，30 ℃、水平轉(zhuǎn)速為 150 rpm 的恒溫?fù)u床過夜，收集細(xì)菌并進(jìn)行質(zhì)粒提取(Rothe 質(zhì)粒提取試劑盒，并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作)，單、雙酶切法再次鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒，并送公司測(cè)序。隨后，按照 Cucchiarini 等[16]已報(bào)道的方法，進(jìn)行重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體在 293T 細(xì)胞中的包裝和擴(kuò)增，具體為：在腺病毒 Ad5 和 Ad8 的輔助下，向 70%～80% 生長(zhǎng)融合的 293T 細(xì)胞加入上述經(jīng)鑒定的 pACP 質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h 后更換一次含谷氨酰胺的胎牛血清培養(yǎng)基，24 h 后收集含 rAAV 載體的病毒粗提液。以 -80 ℃、37 ℃ 各 1 min 反復(fù)凍融 4 次，10000 rpm 超高速離心得病毒上清液，置于 -80 ℃，備用。同樣的方法構(gòu)建、包裝與鑒定 rAAV-lacZ 載體。最后，半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID 50)測(cè)定病毒滴度：在 96 孔板中分 8 個(gè)病毒稀釋梯度 [10-3，10-4，-10-10，每個(gè)梯度 12 孔(一排)，其中前 2 孔為陰性對(duì)照]，加入到 2.5% 胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的 293T 細(xì)胞中，37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10 天。10 天后倒置顯微鏡下觀察，計(jì)算每一排中出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的孔數(shù)，根據(jù) TCID 50＝ 101+d (S-0.5)(d 為 log10稀釋倍數(shù)，S 為陽性孔比率總和)，最后將 TCID 50 轉(zhuǎn)換為空斑形成單位(PFU)/ ml，即：PFUs＝0.7×TCID 50 的滴度。

七、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組 [9-10,12]

將上述純化的含 rAAV-lacZ、rAAV-hCKLF1 病毒液分別加入上述髖關(guān)節(jié)滑膜組織(15 μl / 組織樣 本)和細(xì)胞模型(3 μl / 孔)，靜止 1 min，后加入無血清 DMEM 培養(yǎng)基，輕輕振蕩使病毒與組織塊或細(xì)胞充分接觸，1.5 h 后加入含 10 ng / ml BMP-2，10 mmol / L β-甘油磷酸鈉，50 mg / L 維生素 C， 100 mmol / L 地塞米松和 10% 胎牛血清的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至 21 天。本實(shí)驗(yàn)中 rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定分別采用 X-gal 活組織染色和 Western blot 法檢測(cè)四種模型中 rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率。首先，X-gal 染色定性檢測(cè) rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染結(jié)果，具體為：將上述模型中經(jīng) rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞標(biāo)本用 2% 甲醛溶液固定后，加入新鮮配置的 X-gal 染液，于 30 min，1 h，2 h，光鏡下觀察并拍照，以隨機(jī) 10 個(gè)高倍鏡下的陽性細(xì)胞數(shù)(深藍(lán)色染色)/ 總細(xì)胞數(shù)× 100% 為陽性率，也即轉(zhuǎn)染效率。以上各組實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次。以上兩樣本實(shí)驗(yàn)均分為三組：無病毒轉(zhuǎn)染組(no vector)、rAAV-lacZ 轉(zhuǎn)染組(lacZ)和 rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染組(CKLF1)。

八、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染 21 天后，分別收集組織和細(xì)胞標(biāo)本，進(jìn)行如下操作：對(duì)組織切片行 HE 染色并計(jì)數(shù)單位面積下的細(xì)胞數(shù)[10,16]、水溶性四氮唑法(WST-1)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力[9-10]和 Hoechst 33258 檢測(cè)細(xì)胞 DNA 含量[10,16]。

九、rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后的致炎性細(xì)胞因子分泌

rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染第 20 天時(shí)，更換無血清 DMEM 培養(yǎng)基 100 μl / 孔，24 h 后收集培養(yǎng)體系中的上清液，移入無菌 Eppendorf 管中，置入 -80 ℃，備測(cè)。使用 IL-6 和 TNF-α ELISA 試劑盒分別檢測(cè)樣本中 IL-6 或 TNF-α 的相應(yīng)濃度[10,18]，進(jìn)而判斷 CKLF1 過表達(dá)對(duì)兩者分泌的影響。以上步驟重復(fù) 3 次，結(jié)果取平均值。

十、Confocal 掃描 rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染后對(duì)特異性成骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)的影響 [10]

骨鈣蛋白(OCN)和骨橋蛋白(OPN)是重要的特異性骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，采用與上述判斷 vimentin 蛋白表達(dá)水平一樣的方法對(duì)樣本 OCN 和 OPN 進(jìn)行檢測(cè)。

十一、FQ-PCR 檢測(cè)成骨關(guān)鍵靶基因、CKLF1 及其受體 CCR4 的表達(dá)

使用熒光定量 RT-PCR(FQ-PCR)對(duì) CKLF1 基因轉(zhuǎn)染后樣本的成骨關(guān)鍵靶基因以及 CKLF1 與其受體 CCR4 的表達(dá)進(jìn)行了定量分析(引物序列見表1)[10]。

由獲取的循環(huán)閾值(Ct)值，根據(jù) 2-△△Ct法(目的基因 mRNA 表達(dá)量＝2-△△Ct，△Ct＝△E－△C，△E＝Ct樣本－Ctβ-actin，△C＝Ct對(duì)照組－Ctβ-actin)分別計(jì)算目的基因 CKLF1、CCR4、ALP、Runx2、OPN、OCN和 Col1α2 在不同實(shí)驗(yàn)分組中的表達(dá)量[9-10,18]。

表1 目的基因序列及擴(kuò)增產(chǎn)物、退火溫度、循環(huán)次數(shù)Tab.1 Target gene sequence and amplification products, annealing temperature, number of cycles

十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組間數(shù)據(jù)用單因素方差(one way ANOVA)分析(LSD 法)，兩組間比較采用 Studentt檢驗(yàn)，P≤ 0.050 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及抗 vimentin 蛋白鑒定

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞胞質(zhì)抗 vimentin 抗體呈明顯紅色熒光，胞核亦有少量紅色熒光，呈陽性反應(yīng)，而細(xì)胞核 DNA 與 DAPI 結(jié)合呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。證實(shí)分離的細(xì)胞為滑膜成纖維細(xì)胞(bar＝60 μm)(圖 1)。此外，還可見相同單位面積下，AS 中抗 vimentin 抗體陽性細(xì)胞百分率與正常組的相近似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.27)。

二、rAAV 病毒載體轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

采用 TCID 50 測(cè)定病毒滴度，最終得到的 rAAV-lacZ 滴度為 1×1011病毒顆粒 / ml；使用 OD 260 法進(jìn)行病毒感染效力(MOI)測(cè)定，為 10±2。隨后，將 rAAV-lacZ 和 rAAV-CKLF1 分別轉(zhuǎn)染上述滑膜組織和第 3 代滑膜成纖維細(xì)胞后 3 天，X-gal 染色發(fā)現(xiàn) rAAV 載體能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞，效率高達(dá) 97.50% 以上，與無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0003)，且至少持續(xù) 21 天。rAAV-lacZ、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，收集標(biāo)本分別進(jìn)行 X-gal 染色，rAAV 病毒載體攜帶報(bào)告基因 lacZ 能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織，即 lacZ 組可見明顯的深藍(lán)色陽性染色，轉(zhuǎn)染效率分別為 98.0% 和 97.5%，明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組(15.0% 和 11.5%)、CKLF1 組(14.5% 和 17.0%)，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 6.53 和 6.76 倍以及 8.48 和 5.74 倍(圖 2a，d)；同時(shí)，rAAV-lacZ 能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率分別為 97.5% 和 99.0%，明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組(15.0% 和 17.0%)、CKLF1 組(18.5% 和 21.0%)，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 6.50 和 5.27 倍以及 5.82 和 4.71 倍(圖 2b，e)；Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn) rAAV-CKLF1 基因轉(zhuǎn)染能有效轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞，分別是無病毒轉(zhuǎn)染組的 4.56 和 3.82 倍(圖 2c，f)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0012 和P＝0.0001)。

圖1 正常和 AS 滑膜細(xì)胞抗 vimentin 蛋白免疫熒光檢測(cè) (× 10)Fig.1 Anti-vimentin immunofluorescence assay of normal and AS synovial cells (× 10)

三、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響

rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)原位培養(yǎng)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞增殖(其中，AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染組的單位面積下細(xì)胞總數(shù)為 409.0 個(gè) / mm2，是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 2.00 和 2.09 倍，P＝0.0000)(圖 3a)，進(jìn)一步的 DNA 含量檢測(cè)得到了類似的結(jié)果(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 1.44 和 1.55 倍以及 1.51 和 1.45 倍，P＝0.0260，P＝0.0020)(圖 3b，d)；同樣地，rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖(明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組和 lacZ 組，P＝0.0120，P＝0.0040)(圖 3c)。

圖2 X-gal 染色和 Western blot 檢測(cè) rAAV 載體轉(zhuǎn)染效率 a：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 X-gal 染色；b：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 X-gal 染色；c、f：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 Western blot 檢測(cè)；d：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 X-gal 染色陽性率；e：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 X-gal 染色陽性率Fig.2 X-gal staining and Western blot detection of rAAV vector transfection efficiency a: X-gal staining of the normal and AS hip synovial tissue; b: X-gal staining of the normal and AS hip synovial fibroblasts; c, f: Western blot analysis of the normal and AS hip synovial fibroblasts; d: X-gal positive staining of the normal and AS hip synovial tissue; e: X-gal positive staining of the normal and AS hip synovial fibroblasts

四、rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染對(duì)致炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞進(jìn)行 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，檢測(cè)培養(yǎng)體系上清液中 TNF-α 和 IL-6 表達(dá)水平，結(jié)果表明 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染顯著促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞的致炎性細(xì)胞因子分泌(明顯高于無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組，P＝0.0060、P＝0.0020)(圖 4)。

五、CKLF1 基因過表達(dá)對(duì) OCN 和 OPN 表達(dá)影響

正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 rAAV-hCKLF1 后 21 天，CKLF1 基因過表達(dá)能明顯促進(jìn) AS 成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨相關(guān)靶基因(OCN 和 OPN)(圖 5)。

六、CKLF1 基因過表達(dá)對(duì)成骨關(guān)鍵靶基因的表達(dá)影響

各組 OD 值均在 1.7～2.0；1.0% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，電泳圖條帶清晰，RNA 完整性好，無 DNA 和蛋白質(zhì)污染經(jīng)熔解曲線測(cè)定，得到單峰擴(kuò)增產(chǎn)物，無明顯非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，特異性好。rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá) CKLF1(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 18.25、20.03 倍和 16.31、19.14 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＝0.0056)；相似的結(jié)果也分別在 ALP、Runx2、OPN、OCN 和 Col1α2 的基因表達(dá)被發(fā)現(xiàn)(分別是無病毒轉(zhuǎn)染組、lacZ 組的 3.16、3.56、3.02、3.29 倍；2.48、3.93、2.54、1.47 倍；1.74、1.94、2.82、2.65 倍；1.76、1.86、1.59、1.73 倍；1.81、2.07、2.77、2.97 倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*P＝0.0410，#P＝0.0027)；值得注意的是，CKLF1 基因過表達(dá)對(duì)正?；こ衫w維細(xì)胞上 CCR4 表達(dá)無明顯影響(P＝0.1209)，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞 CCR4 的表達(dá)(P＝0.0381)(圖 6)。

圖3 CKLF1 基因有效促進(jìn)髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞的增殖 a：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織單位面積下細(xì)胞總數(shù)；b～c：正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織 DNA 含量檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；d：WST-1 定量檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖情況Fig.3 CKLF1 gene promoted proliferation of hip synovial tissue and fibroblasts a: The total number of cells per unit area of the normal and ASA synovial tissue; b - c: DNA content detection of the normal and ASA synovial tissue; d: WST-1 quantitative detection of fibroblast proliferation ability

圖4 CKLF1 過表達(dá)促進(jìn)致炎性細(xì)胞因子分泌 a：rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞分泌 IL-6，設(shè)定無病毒轉(zhuǎn)染組的 IL-6 表達(dá)量為 1.0，正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染 rAAV-CKLF1 后，分別是其 2.62 和 3.30 倍 (P = 0.0020)；b：rAAVCKLF1 轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，TNF-α 分別升高 2.97 和 3.57 倍 (P = 0.0060)；c：正常髖關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行 rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后 21 天，IL-6 表達(dá)量明顯增加 (P = 0.0020)；d：滑膜組織的 TNF-α 表達(dá)水平分別升高 1.42 和 1.63 倍 (P = 0.0060)Fig.4 Overexpression of CKLF1 promoted secretion of inflammatory cytokines a: rAAV-CKLF1 transfection promoted the secretion of IL-6 by normal and AS hip synovial fibroblasts (the IL-6 expression level of the virus-free transfection group was 1.0, normal and AS hip synovial fibroblast transfection)After rAAV-CKLF1, they were 2.62 and 3.30 times, respectively (P = 0.0020); b: TNF-α increased by 2.97 and 3.57 times after transfection of rAAV-CKLF1 into fibroblasts respectively (P = 0.0060); c: IL-6 in normal hip synovial tissue expression increased after transfection with rAAV-CKLF1 for 21 days (2.05 and 2.45 times, respectively, in the virus-free transfection group, P = 0.0020); d: TNF-α expression levels of synovial tissue increased by 1.42 and 1.63 fold, respectively (P = 0.0060)

討 論

趨化因子家族是一類由免疫或非免疫細(xì)胞分泌的一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白，與七次跨膜的 G 蛋白偶聯(lián)受體特異結(jié)合，通過 G 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其生物學(xué)活性，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、過敏反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化等過程中發(fā)揮重要作用[2,7-8]。作為趨化因子家族新成員的 CKLF1 被證實(shí)主要有兩方面生物學(xué)功能：廣譜的趨化活性以及較強(qiáng)的促增殖與分化能力。在體外，Han 等[7]用真核表達(dá)載體 pcDI-CKLF1 轉(zhuǎn)染 COS-7 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) CKLF1 具有明顯趨化中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的活性。同時(shí)將 pcDI-CKLF1 裸質(zhì)粒注射到 BALB / c 小鼠肌肉中，注射質(zhì)粒 10 天后，pcDICKLF1 組小鼠肌肉切片中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多。Tan 等[19]將 pcDI-CKLF1 經(jīng)電脈沖肌肉注射導(dǎo)入至小鼠體內(nèi)，CKLF1 基因在肺內(nèi)獲得了高表達(dá)，可逆的引起細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落、間質(zhì)充血水腫，進(jìn)而導(dǎo)致因間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、膠原沉積引起的肺泡壁增厚，可致肺纖維化作用。在哮喘患者的肺組織和外周血白細(xì)胞中，內(nèi)源性 CKLF1 的表達(dá)明顯上調(diào)，提示 CKLF1 在呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)病過程中起到重要的作用。我們的前期研究結(jié)果提示 AS 患者髖關(guān)節(jié)囊滑膜組織 CKLF1 及其受體 CCR4 表達(dá)明顯升高，且與體內(nèi) C 反應(yīng)蛋白、血沉和 D-二聚體等的炎性狀態(tài)存在正相關(guān)[8]。而 Bal 等[20]通過檢測(cè)血清中可溶性白細(xì)胞介素-2 受體(sIL-2R)、IL-6 和 TNF-α 的水平后，認(rèn)為 IL-6 和 TNF-α 在 AS 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，且其水平可作為疾病活動(dòng)度和診斷的評(píng)估工具。Gratacós 等[21]的研究發(fā)現(xiàn) AS 患者致炎性因子(IL-6 和 TNF-α)水平明顯升高，且 IL-6 與 AS 疾病活動(dòng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織及成纖維細(xì)胞過表達(dá) CKLF1 基因后，培養(yǎng)體系中的致炎性細(xì)胞因子 IL-6 和 TNF-α 呈高水平表達(dá)，且上述促炎性作用至少持續(xù) 21 天。IL-6 和 TNF-α 的持續(xù)高表達(dá)將會(huì)趨化更多的致炎性細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)向炎癥部位遷移，進(jìn)而引起致炎性因子“瀑布樣”增加，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[19-21]。

圖5 CKLF1 促進(jìn)骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 OCN 和 OPN 表達(dá) (bar = 60 μm) a：OCN 染色檢測(cè)成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞；b：OPN 染色檢測(cè)成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞Fig.5 CKLF1 gene transfer promoted expression of extracellular matrix proteins OCN and OPN (bar = 60 μm) a: OCN staining of the osteoblast and osteogenic precursor cell; b: OPN staining of the osteoblast and osteogenic precursor cell

圖6 CKLF1 對(duì)其自身信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及成骨分化相關(guān)靶基因表達(dá)的 影響Fig.6 Effects of CKLF1 on its own signal transduction and expression of target genes related to osteogenic differentiation

Ke 等[22]利用 CKLF1 真核細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人和小鼠骨髓干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CKLF1 能促進(jìn)人和小鼠骨髓造血干 / 祖細(xì)胞的增殖和分化，且與 GM-CSF 有協(xié)同刺激作用。Han 等[7]發(fā)現(xiàn)，CKLF1 在小鼠骨骼肌中的過表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖分化加速，增加生肌素的表達(dá)水平及一些生長(zhǎng)因子的活性，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞的增殖。最近，有學(xué)者通過觀察 CKLF1 對(duì)體外培養(yǎng)的人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖作用，首次確定 CKLF1 對(duì)體外培養(yǎng)的人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞具有促增殖作用，提示 CKLF1 可能參與動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)膜增厚的過程[23]。本研究通過對(duì) rAAV-CKLF1 轉(zhuǎn)染后的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織切片后，進(jìn)行 HE 染色并計(jì)數(shù)單位面積下細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CKLF1 基因過表達(dá)能促進(jìn)原位培養(yǎng)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織中的細(xì)胞增殖，此外，還發(fā)現(xiàn) CKLF1 基因轉(zhuǎn)染能有效促進(jìn)體外單層培養(yǎng)的正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞增殖。本研究對(duì) CKLF1 基因過表達(dá)的正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜組織和成纖維細(xì)胞進(jìn)行 DNA 含量檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn) CKLF1 能促進(jìn)兩種體系中的細(xì)胞 DNA 含量增加。表明 CKLF1 基因能通過增強(qiáng) AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞的 DNA 轉(zhuǎn)錄合成和增加細(xì)胞數(shù)目而促進(jìn)其增殖。

Dalby 等[24]認(rèn)為 OCN 和 OPN 可作為檢測(cè)成骨細(xì)胞和成骨前體細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。筆者對(duì)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞 CKLF1 基因過表達(dá)對(duì)其成骨關(guān)鍵靶基因表達(dá)可能的影響研究中，發(fā)現(xiàn) rAAV-hCKLF1 轉(zhuǎn)染能促進(jìn)正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞表達(dá) ALP、Runx2、OPN、OCN 和 Col1α2。而在 CKLF1 轉(zhuǎn)染正常和 AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞后的 OPN 和 OCN 免疫熒光檢測(cè)中也有相類似的發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，CKLF1 基因過表達(dá)對(duì)正常滑膜成纖維細(xì)胞上 CCR4 表達(dá)無明顯影響，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞 CCR4 的表達(dá)，這也可能部分解釋 CKLF1 在促進(jìn)正常和 AS 滑膜成纖維細(xì)胞增殖方面的作用相似，但能促進(jìn) AS 滑膜成纖維細(xì)胞分泌更多的致炎性細(xì)胞因子表達(dá)。以上結(jié)果還表明，CKLF1 基因一方面可能通過增強(qiáng)成纖維細(xì)胞中的成骨關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化；還可能通過增加成骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝與沉積，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣、磷聚集和基質(zhì)礦物質(zhì)化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向成骨轉(zhuǎn)化，進(jìn)而成為成骨細(xì)胞和發(fā)揮成骨功能。上述研究發(fā)現(xiàn)也與筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[10]，即 CKLF1 能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)囊兩種組織細(xì)胞(韌帶和滑膜)的成骨轉(zhuǎn)化，因而有理由推測(cè) CKLF1 可能在 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化過程中發(fā)揮重要作用。

綜合以上研究結(jié)果表明，CKLF1 能促進(jìn) AS 髖關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和致炎性細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)其成骨轉(zhuǎn)化相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，推測(cè) CKLF1 在 AS 關(guān)節(jié)周圍成纖維細(xì)胞成骨轉(zhuǎn)化至病理性骨化過程中可能發(fā)揮重要作用。因而，繼續(xù)深入研究 CKLF1 和成骨相關(guān)信號(hào)通路之間的相互作用關(guān)系及其在關(guān)節(jié)病理性骨化動(dòng)物模型中的作用及機(jī)制，為靶向 CKLF1 信號(hào)防治 AS 關(guān)節(jié)病理性骨化與強(qiáng)直提供新的理論基礎(chǔ)。