豬高致病性藍耳病、圓環(huán)病毒病和鏈球菌病混合感染的診斷

孫光野，張洪友＊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

豬高致病性藍耳病、圓環(huán)病毒病和鏈球菌病混合感染的診斷

孫光野，張洪友＊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

為了對黑龍江省某豬場發(fā)生的豬病確診，首先采用了流行病學調(diào)查、臨床檢查和病理解剖初步懷疑是豬圓環(huán)病毒病和鏈球菌病混合感染，然后無菌取病豬脾臟、淋巴結進行細菌分離，分離純化后的細菌經(jīng)革蘭氏染色、生化實驗和動物實驗，鑒定為豬鏈球菌；提取脾臟和淋巴結DNA、RNA經(jīng)PCR檢測出豬圓環(huán)病毒和豬高致病性藍耳病毒的核酸陽性條帶。說明了該病豬確系豬圓環(huán)病毒、豬高致病性藍耳病毒和豬鏈球菌的混合感染。藥敏試驗結果表明，該分離菌對青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素不敏感，對頭孢咪唑、環(huán)丙沙星、氟哌酸高度敏感。并結合豬場的發(fā)病情況和試驗結果提出了防疫方案和治療措施，為豬場防治豬圓環(huán)病毒病、豬高致病性藍耳病與鏈球菌混合感染提供了參考。

豬高致病性藍耳?。回i圓環(huán)病毒?。回i鏈球菌??；混合感染

豬圓環(huán)病毒感染是由豬圓環(huán)病毒引起的豬的一種新的傳染病。其臨診表現(xiàn)多種多樣，主要特征為體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸、生長發(fā)育不良、腹瀉、呼吸困難、母豬繁殖障礙、內(nèi)臟器官及皮膚的廣泛病理變化，特別是腎、脾臟及全身淋巴結的高度腫大、出血和壞死。本病還可導致豬群產(chǎn)生嚴重的免疫抑制[1]，從而容易導致繼發(fā)或并發(fā)其他傳染病。

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱豬藍耳病，是由病毒引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)的傳染病[2]。其特征為厭食、發(fā)熱、母豬懷孕后期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎；幼齡仔豬發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病和大量死亡。高致病性豬藍耳?。℉PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）變異株引起的一種急性高致死性疫病。PRRSV 容易發(fā)生變異，最直接有力的證據(jù)就是高致病性藍耳病病毒出現(xiàn)毒力增強的現(xiàn)象[3-5]。

豬鏈球菌病是由鏈球菌屬中致病性鏈球菌所致的一種傳染病。多發(fā)于3～12 周齡的豬，尤其是斷奶仔豬易感染此病，臨床上主要表現(xiàn)為淋巴結膿腫、腦膜炎、關節(jié)炎以及敗血癥等癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

2016年10月15日，黑龍省某豬場送來2頭7周齡的病豬，通過流行病學調(diào)查得知，該豬場規(guī)模400頭，發(fā)病豬70頭，每天死亡8頭左右，發(fā)病率17.5%，死亡率2%。發(fā)病的豬食欲廢絕，體溫升高，跛行。通過對送檢病豬觀察，表現(xiàn)為精神委頓、喜臥不動、呼吸困難、眼瞼水腫、糞便稀便。然后病理剖檢發(fā)現(xiàn)腸系膜淋巴結水腫、腎臟周圍脂肪水腫；脾臟腫大、壞死、色暗；肺臟充血；胃腸黏膜出血。初步懷疑是豬圓環(huán)病毒和鏈球菌感染，但病理剖檢情況復雜，無法確診，所以還需進行實驗室診斷來確診。

1 材料

1.1 病料及試驗動物

無菌取該豬場送檢病豬的肺臟、肝臟、脾臟和淋巴結。

試驗動物為4只8周齡的小白鼠，黑龍江八一農(nóng)墾大學預防教研室提供。

1.2 試劑及儀器

Marker購自大連寶生物工程有限公司；TIANamp Virus DNA/ RNA Kit 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒購自廣州東盛生物科技有限公司；RevertAid Fir st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄盒購自MBI公司。革蘭氏染液購自青島海博生物技術有限公司；藥敏片購自廣州市宜康生物科技有限公司；鮮血瓊脂培養(yǎng)基由黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院預防獸醫(yī)學實驗室制備；普通肉湯培養(yǎng)基購自上海研生實業(yè)有限公司；微量生化管購自杭州天和微生物試劑有限公司；電子顯微鏡（型號為OlympusCX3）購自南京艾朗儀器有限公司；紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（型號為Gel Doc 2 000）購自美國Bio-RAD公司；PCR儀（型號為TP600）購自寶生物工程(大連)有限公司。

2 方法

2.1 細菌分離培養(yǎng)和染色鏡檢

將無菌采取的肝臟、肺臟接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。涂片鏡檢后挑取單個菌落進行純化培養(yǎng)。

2.2 生化試驗

無菌取分離菌純培養(yǎng)物分別接種于葡糖糖、甘露醇、麥芽糖、木糖、棉籽糖，乳糖、肌醇微量生化管中，同時進行M.R.試驗和V-P試驗。37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其生化反應特性。

2.3 動物試驗

挑取純化后的單菌落，經(jīng)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)后經(jīng)生理鹽水稀釋制成細菌懸液（5×106cfu/mL），腦內(nèi)注射2只8周齡小鼠，劑量為0.2 mL/只，對照組的兩只小鼠注射同等劑量的生理鹽水，觀察結果。

2.4 藥敏試驗

挑取純化后的單菌落，經(jīng)營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)后吸取100μL 滴在血瓊脂培養(yǎng)基上，用滅過菌的三角棒均勻涂抹于血瓊脂平板表面，以確保細菌能在平板上廣泛生長。用無菌鑷子將藥敏片分別貼于培養(yǎng)基表面，各藥敏片間隔一定距離。37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結果，測定抑菌圈直徑。

2.5 病毒基因組的提取

將剖檢豬的脾臟和淋巴結充分研磨，按照 TIANamp Virus DNA/ RNA Kit 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書的操作步驟分別提取病毒的DNA和RNA，按RevertAidFirst S trand cDNA Synthesis Kit 反轉錄盒的說明書操作步驟將提取的病毒RNA進行反轉錄，得到病毒 cDNA。

2.6 PCR檢測

以試劑盒提取得到的病毒DNA、反轉錄得到cDNA為模板，用豬瘟病毒、普通豬藍耳病毒、豬高致病性藍耳病毒、豬偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒的特異性引物進行PCR反應擴增，PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用紫外凝膠成像儀分析。

3 結果

3.1 細菌的分離培養(yǎng)結果

從37 ℃培養(yǎng)24 h的血瓊脂培養(yǎng)基中，可見長出灰白色、圓形、光滑、濕潤、邊緣整齊半透明的小菌落，菌落周圍形成β溶血環(huán)。

3.2 革蘭氏染色結果

將病料中所分離的細菌進行純培養(yǎng)，然后對其進行革蘭氏染色、涂片、鏡檢。可見到革蘭氏陽性鏈狀球菌，結果見圖1。

圖1 細菌革蘭氏染色結果（10×10）

3.3 生化試驗結果

37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，結果見表1。由表1可知，鑒定結果符合豬鏈球菌的生化特性。

表1 生化特性試驗結果

3.4 動物致病性試驗結果

腦內(nèi)注射2只8周齡小白鼠，小鼠在28 h均死亡，對照組沒有死亡。無菌取死亡小白鼠的肺臟、淋巴結和脾臟接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，結果分離鑒定與以上的豬鏈球菌一致。

3.5 藥敏試驗結果

該分離菌對青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素已經(jīng)產(chǎn)生了較強的耐藥性；對頭孢咪唑、環(huán)丙沙星、氟哌酸高度敏感，結果見表2。

表2 藥敏試驗結果

3.6 PCR擴增結果

以得到的病毒DNA、反轉錄得到cDNA為模板，用豬瘟病毒、豬普通藍耳病毒、豬高致病性藍耳病毒、豬偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒的特異性引物進行PCR擴增，引物由哈爾濱博仕生物有限公司合成。引物序列、擴增基因名稱及大小見表3，結果見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電

表3 引物列表

4 討論

通過對黑龍江省某豬場送檢的病豬進行流行病學調(diào)查、臨床檢查和病理解剖，初步懷疑是豬圓環(huán)病毒與豬鏈球菌的混合感染，但病理解剖情況復雜，無法確診。然后通過實驗室診斷確診為豬圓環(huán)病毒、豬高致病性藍耳病毒和鏈球菌的混合感染。雖然該豬場接種了豬圓環(huán)疫苗，但抗體水平不足以抵抗病毒的侵襲，造成疫病流行，所以應制訂合理的免疫程序，合理地投喂抗生素，避免繼發(fā)感染。鏈球菌在血液瓊脂平板上會出現(xiàn)溶血的現(xiàn)象，可分為α、β、γ三種類型溶血鏈球菌。根據(jù)以上分類標準，結合該菌在血瓊脂培養(yǎng)基出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象可判斷為β型溶血鏈球菌。根據(jù)藥敏試驗結果，該分離菌對青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素已經(jīng)產(chǎn)生了較強的耐藥性，這應該是豬場濫用抗生素所致，對頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、氟哌酸高度敏感，可能是豬場未廣泛使用。因此可以把頭孢氨芐、環(huán)丙沙星、氟哌酸作為治療鏈球菌的首選藥物。

因為目前國際上還沒有有效的疫苗用于PCV2感染的免疫預防[6]，因此控制PCV2感染的主要措施包括：加強環(huán)境消毒和飼養(yǎng)管理，減少仔豬應激。感染PRRS病豬從恢復期開始即可產(chǎn)生免疫力，對于再次感染PRRSV均有抵抗力。因此，在地方流行性區(qū)域內(nèi)給豬接種疫苗對預防繁殖障礙是比較有效的?；兼溓蚓膭游?，自愈后機體所產(chǎn)生的免疫力，足可抵御鏈球菌再感染。因此，應用疫苗進行免疫接種，對預防和控制本病傳播效果顯著。

近年來隨著集約化豬場的發(fā)展，豬場的疾病情況變得越來越復雜，病毒性疾病混合感染細菌性疾病日趨嚴重[7]，豬的死亡率也越來越高，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。作為豬場經(jīng)營管理者，平時應建立和建全消毒隔離制度。保持圈舍清潔、干燥及通風，經(jīng)常清除糞便，定期更換墊草，保持地面清潔。引進動物時必須經(jīng)檢疫和隔離觀察，確認健康時方能混群飼養(yǎng)。制訂合理的免疫保健程序，加強管理，冬季做好防風防凍措施，增強豬的自身抗病力，也是預防疾病的重要措施。

[1] 董林.豬圓環(huán)病毒2型診斷試劑盒的研制與應用[D].長春：吉林大學，2014.

[2] 伍和明，謝齊斌，李東生，等.桂林市高致病性豬藍耳病流行病學調(diào)查 [J].中國動物檢疫，2013(12)：46-47.

[3] 王榮.豬瘟和藍耳病快速檢測方法的建立和應用[D].福州：福建農(nóng)林大學，2009.

[4] MORTENSEN S，STRYHN H，SGAARD R，et al. Risk factors for in-fection of sow herds with porcine reproductive and respiratorysyndrome (PRRS) virus [J]. Prev Vet Med，2002，53 (1/2)：83-101.

[5] LABARQUE G ，REETH KV ， NAUWYNCK H， et al. Impact of genet-is diversity of European-type porcine reproductive and respiratorysyndrome virus strains on vaccine efficacy [J].Vaccine，2004，22(31/32)：4183-4190.

[6] 王一平，郭龍軍，唐青海，等.豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進展[J].畜牧獸醫(yī)學報，2012，43(9)：1337-1345.

[7] 謝嘉林，王立功，謝占民.中小規(guī)模豬場的疾病防控措施 [J].湖北畜牧獸醫(yī)，2015，36(6)：36-37.

2016-11-17）

孫光野 (1992- ),男,碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)代謝病，940495242@qq.com.

*通信作者：張洪友(1960- ),男，碩士,教授，碩士生導師，研究方向為動物營養(yǎng)代謝病.