橡膠樹HbHMGS1啟動子對光照、干旱及熱擊處理的表達響應

鞏笑笑，閆冰玉，譚玉榮，王 鵬，李雙江，王 藝，周璐瑤，劉進平

(海南大學 熱帶農(nóng)林學院/海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室， ?？?570228)

橡膠樹(Heveabrasiliensis)作為最主要的產(chǎn)膠植物已在我國海南、云南、廣東、廣西及福建等地區(qū)廣泛種植。天然橡膠因其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及國防領(lǐng)域的廣泛應用，已成為不可或缺的工業(yè)原料及戰(zhàn)略物資[1-4]。目前，天然橡膠的生物合成已取得較大進展，但是橡膠生物合成的調(diào)控機制研究仍然很少[5]。天然橡膠是以異戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP)作為單體聚合形成的聚異戊二烯(cis-1,4,-polyisoprene)[6]。目前認為，在高等植物中IPP通過甲羥戊酸(mevalonic acid,MVA)及甲基赤蘚醇四磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)2條途徑合成，但早期放射性標記實驗證明，天然橡膠生物合成的前體IPP來源于MVA途徑[7]。其中，羥甲基戊二酰輔酶A合酶(3-hydroxy-3-methylgutaryl-CoA synthase,HMGS)是橡膠樹中參與橡膠生物合成及MVA途徑中其他類異戊二烯生物合成的關(guān)鍵酶[8]，橡膠樹中編碼該酶的基因已被克隆，SUWANMANEE等[9]與SIRINUPONG等[10]先后克隆了該基因家族的2個成員hmgs1和hmgs2，且hmgs1在乳膠細胞的表達量要比葉片中高，hmgs2在乳膠、葉柄及葉片中的mRNA表達量各不同，其中，乳膠中的表達量最高，葉柄次之，葉片中最低。研究表明，HbHMGS基因的cDNA序列與擬南芥和樟子松的cDNA序列相似性分別達到了81%及74%[9]。目前已有研究表明，乙烯利刺激橡膠樹后能夠顯著增加HbHMGS的酶活性[11]，但是尚未見光照、干旱和熱擊等環(huán)境因素對該基因表達調(diào)控的報道。啟動子是基因編碼區(qū)上游與基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一段非編碼DNA序列，并且在基因表達與調(diào)控方面起到重要作用[12]。植物啟動子根據(jù)基因表達調(diào)控類型不同可以分為組成型、誘導性及組織特異型啟動子幾種類型[13]。目前，花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子和nos(胭脂堿合酶)啟動子[14]是應用比較廣泛的組成型啟動子[15]，它能在雙子葉轉(zhuǎn)基因植物中高效表達[16]。由于啟動子在表達調(diào)控方面的重要作用，筆者克隆了橡膠樹HbHMGS1基因啟動子，并構(gòu)建與GUS基因融合的植物表達缺失載體，通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥進行表達分析，確定了HbHMGS1啟動子在T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的組織特異性及對光照、干旱及熱擊等處理響應表達情況，旨在了解HbHMGS1基因表達模式及其在橡膠生物合成與對非生物脅迫響應中的作用。

1 材料與方法

1.1材料本實驗所用的橡膠樹葉片取自海南大學試驗基地熱研7-33-97品系嫁接植株。野生型擬南芥種子哥倫比亞型(col-0)及煙草種子(本生煙)，植物表達載體pCAMBIA1301，農(nóng)桿菌菌株GV3101均由本實驗室保存；LA Taq DNA polymerase(TaKaRa, RR02MB )，限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)，T4DNA連接酶(TaKaRa)均購自大連寶生物公司；質(zhì)粒DNA提取(OMEGA，D6943-02)和膠回收試劑盒(OMEGA，D2500-02)購自北京智遠方杰有限公司；生化試劑購自上海生工，Marker，抗生素及19T載體購自大連寶生物公司。引物合成和基因測序由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。GUS染液配置：2 mmol·L-1X-GLuc,100 mmol·L-1Na3PO4緩沖液，5 mmol·L-1K3Fe(CN)6,5 mmol·L-1K4Fe(CN)6，10 mmol·L-1EDTA, 0.2% Triton X-100。

植物材料的處理：(1)光照處理：選取2組長勢基本一致且健康的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，分別置于持續(xù)光照和黑暗條件下進行處理，分別在處理12，24，48，72，96，120和144 h后進行取樣。(2)熱擊與干旱處理：將2組含有6個缺失片段的轉(zhuǎn)基因苗1組放置在37 ℃培養(yǎng)箱(16 h光照/8 h黑暗)中進行熱擊處理5 h后取樣，另外1組置于原來環(huán)境中停澆水約10 d后進行取樣，各缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥苗作為對照不進行任何處理。含有CaMV35S啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同時進行以上處理。

1.2HbHMGS1啟動子克隆及缺失表達載體的構(gòu)建以橡膠樹葉片為主要材料，采用CTAB法提取基因組DNA。下載NCBI上已發(fā)布的橡膠樹HbHMGS1基因mRNA序列(GenBank Accession number:AF396829)和橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)庫[17]進行BLAST比對，獲取HbHMGS1啟動子序列。利用Primerpremier5軟件設(shè)計正向引物HbHMGSP-F：CGggatccGCAAACAAGAGGAATGGTTG 及反向引物HbHMGSP-R： CATGccatggTCTCTACGCCTCTCCAATTCC擴增HbHMGS1基因起始密碼子ATG上游1 656 bp的序列，在基因的上下游引物中分別引入了BamHI和NcoI酶切位點，進一步構(gòu)建T載體送測序。以驗證正確的包含HbHMGS1啟動子質(zhì)粒DNA為模板，分別在HbHMGS1啟動子上游-1290/-1、-1040/-1、-699/-1、-454/-1及-213/-1(ATG)處設(shè)計5′缺失特異性引物作為上游引物，反向引物不變，通過PCR擴增HbHMGS1啟動子5′側(cè)翼序列各缺失片段。引物序列分別是，D2-cF(-1290/-1)：CGggatccTCCTTAAATTTAAGAGTTTAACGAG；D3-cF(-1040/-1)：CGggatccTGGATGGCTTCTGATTTGGT；D4-cF(-699/-1)：CGggatccGATTCGTGTCGCATGAGGTT；D5-cF(-454/-1)：CGggatccGAAGTGGGCTCCAAAAGATT和D6-cF(-213/-1)：CGggatccTTCTCTCCTTGCTGCTTCCA。PCR產(chǎn)物膠回收后，連接T載經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化后測序驗證。將攜帶HbHMGS1啟動子5′各缺失片段的T載體用限制性內(nèi)切酶BamHI和NcoI進行雙酶切，同時用這2個酶對植物表達載體pCAMBIA1301進行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物回收后進行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建各缺失片段與GUS基因的融合表達載體，各構(gòu)建載體分別命名為D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213。

1.3生物信息學分析將克隆獲得的HbHMGS1啟動子序列，通過DNAMAN的生物信息分析軟件進行序列比對，利用PlantCARE[18](http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線軟件進行分析預測，以期對HbHMGS1啟動子的功能進行初步的預測。

1.4農(nóng)桿菌介導的煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的HbHMGS1啟動子各缺失片段與GUS融合的植物表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌菌株中，取適量的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)至100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液體培養(yǎng)基中，至OD600值為1.5～2.0，用10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES(pH5.7)和400 μmol·L-1AS(乙酰丁香酮)的無菌溶液懸浮，調(diào)整菌液濃度使其OD600值約為2.0，室溫靜置3 h后用無針頭的注射器將懸浮液注射到生長1月左右的煙草葉片背面，28 ℃培養(yǎng)3 d，然后用打孔器取葉片進行GUS染色。

1.5擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的鑒定將前期保存的HbHMGS1啟動子及其缺失啟動子菌液擴大培養(yǎng)到100 mL LB+Rif(25 mg·L-1)+kan(50 mg·L-1)液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至OD600=1.0～1.3；5 000 r·min-1離心10 min后收集農(nóng)桿菌細胞；配置w=5%蔗糖的侵染液溶解農(nóng)桿菌沉淀，并調(diào)整OD600≈1.0，轉(zhuǎn)化前加φ=0.02%的Silwet L-77，采用浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。剪去長勢較好的野生型擬南芥植株的果夾，將未授粉的花序浸沒在侵染液中約90 s。待植株成熟后收取T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用φ=70%酒精及w=10%次氯酸鈉進行殺菌，最后將種子均勻平鋪在含有50 g·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選。將轉(zhuǎn)入HbHMGS1啟動子及其他缺失片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥T0代種子經(jīng)潮霉素抗性板篩選后，待其成熟進一步提取T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的DNA，以DNA為模板使用特異性引物和GUS引物進行PCR檢測。

1.6組織化學染色及GUS活性熒光檢測取T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗不同時期和成熟階段各組織器官進行GUS染色，以X-Gluc為底物，GUS染液浸沒材料即可，37 ℃過夜，用70%乙醇脫色后，觀察染色結(jié)果并拍照。GUS活性的定量分析利用4-MUG作為底物[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1HbHMGS1啟動子和其缺失片段克隆以及植物表達載體的構(gòu)建橡膠樹HbHMGS1啟動子及5'缺失片段的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，分別在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp處可見特異性單一的條帶，與預期目的條帶大小相似(圖1A)。進一步進行產(chǎn)物膠回收，連接pMD19T載體后進行測序，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫序列一致。將以上測序驗證正確的包含HbHMGS1啟動子及5′各缺失片段的T載體酶切后進一步構(gòu)建與GUS基因的融合植物表達載體。對目的表達載體進行雙酶切驗證，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1B所示，分別在1 600 bp，1 200 bp，1 000 bp，700 bp，500 bp及250 bp處各切出一條單一的條帶，這些條帶大小與預期結(jié)果相符。進一步測序驗證，用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與原始序列比對后，序列正確。結(jié)果表明HbHMGS1啟動子和其5'缺失片段與GUS基因融合的植物表達載體構(gòu)建成功。

2.2HbHMGS1啟動子序列特征分析將克隆獲得的HbHMGS1啟動子序列，通過PlantCARE在線軟件分析，預測結(jié)果(圖2)表明，HbHMGS1啟動子含有TATA-box、CAAT-box等基本順式作用元件以及多種調(diào)控元件，如4個光反應相關(guān)元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif、1個乙烯響應元件ERE、1個赤霉素響應元件GARE-motif、2個茉莉酸響應元件CGTCA-motif、TGACG-motif、1個熱脅迫相關(guān)元件HSE及1個干旱響應元件MBS等其他重要作用元件。

圖2 橡膠樹HbHMGS1啟動子順式作用元件分析

2.3煙草葉片瞬時表達分析筆者將構(gòu)建好的6個與GUS基因融合的表達載體D1-1656，D2-1290，D3-1040，D4-699，D5-454及D6-213和陽性對照pCAMBIA1301通過農(nóng)桿菌介導的方法分別轉(zhuǎn)化到煙草葉片中進行瞬時表達。取包含每個缺失片段的煙草葉片進行GUS染色，結(jié)果顯示，缺失片段D1-1656、D2-1290、D3-1040、D4-699及D5-454都能夠啟動GUS基因的表達，葉片染色顯藍色，但是D6-213缺失啟動子卻不能夠啟動GUS基因的表達，GUS染色沒有呈現(xiàn)藍色，這一結(jié)果可能是因為距ATG上游的213 bp(-213/-1)缺少了轉(zhuǎn)錄起始或翻譯必須的順式作用元件，導致下游GUS蛋白不能夠正常表達，且35S啟動子能夠正常啟動GUS蛋白表達，GUS染色顯藍色(圖4)，說明HbHMGS1啟動子具有啟動活性。

2.4HbHMGS1啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的功能分析

2.4.1 HbHMGS1啟動子組織特異性分析按照上述方法將構(gòu)建好的HbHMGS1啟動子與GUS融合的植物表達載體通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥。將檢測為陽性植株的T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行GUS染色，獲得了9株T1代株系，隨機挑選2個株系進行GUS組織化學染色，分別選取了種子春化后生長6，12和17 d的幼苗，45 d成熟植株的根、莖、葉、花絮、果莢，以及17 d的35S驅(qū)動GUS轉(zhuǎn)基因植株和野生型擬南芥進行GUS染色，染色結(jié)果表明，HbHMGS1啟動子能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的幼苗及成熟苗的各個組織中啟動GUS基因的表達，且染色后呈現(xiàn)明顯的藍色，35S啟動子轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色也很明顯，但是野生型擬南芥顯示GUS基因沒有表達(圖5)。

2.4.2 HbHMGS1啟動子光照處理GUS活性表達分析筆者將2組含有HbHMGS1啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株同時進行光照及黑暗處理后進行取樣提蛋白測其酶活。結(jié)果顯示：在持續(xù)光照條件下，光照24，48，72 h后，GUS蛋白活性逐漸上升，且光照處理96 h后，GUS活性增大到處理72 h的3.2倍，但是在處理120 h后，GUS活性下降到原來水平，隨后保持平穩(wěn)(圖6)。持續(xù)黑暗處理轉(zhuǎn)基因擬南芥苗后，黑暗處理12 h～48 h后，葉片GUS活性檢測持續(xù)上升，在繼續(xù)處理72，96 h后葉片GUS活性顯著增加，且分別是處理48 h時GUS活性的1.38倍和2.13倍，但是在黑暗處理120 h后GUS活性沒有繼續(xù)顯著上升，與處理96 h后GUS活性相近(圖6)。

2.4.3 HbHMGS1啟動子及其缺失片段響應熱擊和干旱處理表達分析熱擊(37 ℃)脅迫時，如圖7A所示，D4-699、D5-454和D6-213缺失片段GUS活性都有明顯的增強，且分別是未處理之前的1.40倍，1.54倍及1.94倍 ，表明-699到起始密碼子-1處的這一段序列中可能存在數(shù)個響應熱擊處理的元件，且-1656到-699這一區(qū)域在響應熱擊處理后可能抑制了GUS基因的表達(圖7A)。干旱脅迫時，如圖7B所示，HbHMGS1啟動子及其各缺失片段GUS活性檢測基本有下降，但D6-213缺失片段GUS活性增加了1.63倍(圖7B)。以上數(shù)據(jù)表明：HbHMGS1啟動子響應熱擊區(qū)域可能主要集中在距起始密碼子-1到上游-699這一段序列中；干旱響應區(qū)域則則主要位于-213到起始密碼子-1(ATG)處的213bp序列中。

3 討 論

本研究以GUS基因作為報告基因，通過煙草瞬時表達及穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥實驗分析HbHMGS1 基因5′上游啟動子序列的啟動活性，PlantCARE在線軟件預測發(fā)現(xiàn)HbHMGS1啟動子包含多種調(diào)控元件，通過GUS組織化學染色實驗發(fā)現(xiàn)，HbHMGS1啟動子在轉(zhuǎn)基因擬南芥的幼苗時期及成熟時期的各組織器官中都有啟動活性，其他研究發(fā)現(xiàn)芥菜中HMGS基因也可以在植株所有器官中表達[21]。 以上這一結(jié)果可能是因為類異戊二烯是植物中分布廣泛的代謝物，且參與多種重要的生理過程，而HMGS基因?qū)τ谏a(chǎn)各種類異戊二烯化合物起到至關(guān)重要的作用[22,23]，因此，HbHMGS1啟動子能夠驅(qū)動GUS蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的各個組織器官中表達。

PlantCARE在線軟件預測發(fā)現(xiàn)HbHMGS1啟動子有4個光響應相關(guān)元件AT1-motif、Box 4、Box I、GAG-motif，且分布在該啟動子序列的多個部位。因此，本研究對包含HbHMGS1啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行了光照和黑暗處理，在光照處理96 h左右，GUS活性瞬間增大后又降低到原來水平，同樣在黑暗處理下，GUS活性逐漸上升且在96h左右明顯增加，但與光照條件下不同的是，GUS活性并沒有急劇下降而是持續(xù)增大該結(jié)果表明，HbHMGS1啟動子可能同時受光照和黑暗影響。本研究對T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株熱擊處理后，發(fā)現(xiàn)缺失啟動子D4-699、D5-454及D6-213和對照相比GUS活性上升，D1-1656、D2-1290及D3-1040 GUS活性則下降，結(jié)果表明，-699到-1和-1656到-699分別存在正調(diào)控和負調(diào)控的熱擊信號。啟動子在線作用元件預測結(jié)果顯示，-1656/-1290、-1290/-1040、-1040/-699及-213/-1幾個區(qū)域均存在熱擊響應元件HSE(AAAAAATTTC)，但是定量GUS活性檢測中發(fā)現(xiàn)，存在熱擊響應元件HSE的幾個缺失啟動子正負調(diào)控并不一致。預測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HbHMGS1啟動子中包含有干旱誘導的響應元件MBS，分別位于-1656到-1290和-454到-213這兩個區(qū)域，但是，經(jīng)干旱處理各缺失啟動子后，GUS活性除D6-213缺失啟動子外均表現(xiàn)下降，MBS干旱誘導響應元件可能在負調(diào)控方面起到重要作用，但仍需進一步的實驗驗證。