外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗生理特性的影響

董文科， 馬 祥， 周學(xué)文， 路旭平， 王 佳， 何 娟， 王 巖， 馬暉玲*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070；2. 青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810016)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是栽培面積最廣的多年生豆科牧草之一，其品質(zhì)優(yōu)良、營養(yǎng)成分豐富、適口性佳且易于栽培，被譽(yù)為“牧草之王”[1]。低溫脅迫是影響植物正常生長的重要因素，嚴(yán)重時可以引起植株死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失[2]。在我國北方高緯度、高海拔地區(qū)，苜蓿受低溫影響發(fā)生凍害和死亡的現(xiàn)象時常發(fā)生，導(dǎo)致苜蓿產(chǎn)量降低，嚴(yán)重限制了苜蓿產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[3-4]。因此，苜蓿的抗寒性和抗寒機(jī)理的研究已引起人們的廣泛重視。

甘氨酸甜菜堿(glycine betaine,GB,簡稱甜菜堿)是一種廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)的季銨型水溶性生物堿，是維持細(xì)胞穩(wěn)定的重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[5]。在逆境條件下，植物體內(nèi)大量積累甜菜堿，以降低滲透脅迫對細(xì)胞膜的損傷，保護(hù)三羧酸循環(huán)的主要酶活性以及穩(wěn)定光合作用中多肽的功能等[6-7]，從而提高植物適應(yīng)不良環(huán)境的能力。現(xiàn)有研究表明甜菜堿有提高植物抗寒性的作用，低溫脅迫可以誘導(dǎo)小麥(Triticumaestivum)、草莓(Fragariaananassa)、大麥(Hordeumvulgare)等作物體內(nèi)甜菜堿的積累[8-10]。目前，提高植物體內(nèi)甜菜堿的研究主要有兩種方式，一是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將甜菜堿合成酶基因?qū)胫仓牦w內(nèi)，篩選獲得抗逆性較強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株；二是通過葉面噴施或根部澆灌外源甜菜堿，提高植物抗逆能力[11-12]。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)其穩(wěn)定性和安全性仍存在較大爭議，因此外源甜菜堿的研究和應(yīng)用顯得尤為重要。研究表明，外源甜菜堿易于被植物葉片或根系吸收，且不易被快速降解[12]，因此通過施加外源甜菜堿提高植物抗寒能力是一種切實(shí)可行的手段之一。目前對于提高苜?？购芰Φ难芯恐饕诟牧荚耘啻胧┖褪┓史绞椒矫鎇13-14]，施加外源甜菜堿能否有效提高苜蓿的抗寒性的研究均鮮見報道。為此，本研究選取抗寒性較弱的‘甘農(nóng)5號’紫花苜蓿為材料，研究葉施和根施不同濃度的甜菜堿對低溫脅迫下苜蓿幼苗抗逆相關(guān)指標(biāo)以及內(nèi)源甜菜堿積累的影響，旨在為甜菜堿在苜?？购缘难芯颗c應(yīng)用中提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)于2017年9月-11月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培養(yǎng)室中進(jìn)行。供試材料為‘甘農(nóng)5號’紫花苜蓿(MedicagosativaL ‘Gannong No.5’)，該品種具有產(chǎn)量高、高抗蚜蟲兼抗薊馬等特點(diǎn)，對寒冷環(huán)境的耐受性較差，屬于非秋眠類型[15]，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。外源甜菜堿購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取顆粒飽滿、大小一致的苜蓿種子，經(jīng)20 % NaClO消毒后，均勻播種在含營養(yǎng)土(營養(yǎng)土∶蛭石=2∶1)的育苗缽(直徑25 cm×高度20 cm)中，每個處理6盆。在人工培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，晝夜溫度為25(±1)℃；時長為白天16 h，夜晚8 h；光照強(qiáng)度為6 000 lx；相對濕度50～70%。待苜蓿幼苗長至20 cm左右時，每盆選取長勢一致的5株幼苗定植并進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

試驗(yàn)共設(shè)置6個外源甜菜堿濃度，即0 (清水對照CK0)，10，20，30，40，50 mmol·L-1和2種施加方式，即葉面施加和根部施加，同時設(shè)置常溫對照(CK)，共13個處理。葉面施加時在外源甜菜堿溶液中加入0.1% Tween-20，以所有葉片均噴施到溶液并且液體自然滴落為止，每株約50 mL，根部施加外源甜菜堿時，使用注射器將外源甜菜堿溶液均勻的注于苜蓿幼苗根部周圍，每株約50 mL，常溫對照(CK)以等體積的蒸餾水代替；連續(xù)施加3 d后，將各處理的育苗缽放置在4℃的低溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫處理，除溫度外其他培養(yǎng)條件同前，常溫對照(CK)為25(±1)℃，處理7 d后取樣和測定分析。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1株高、根長及干重測定 隨機(jī)從各處理中選取10株苜蓿幼苗，測量幼苗從地面到植株最高部位的絕對高度；用去離子水將根系沖洗干凈，測量根基部到根尖的長度；測量結(jié)束后，將苜蓿幼苗按地上部和地下部分開，吸干表面水分，放入烘箱105℃殺青30 min，65℃烘干至恒重后用電子天平稱重。

1.3.2葉綠素含量測定 采用乙醇提取法測定[16]。

1.3.3可溶性糖和脯氨酸含量測定 可溶性糖(soluble sugar,SS)含量采用蒽酮比色法測定[16]；游離脯氨酸(proline,Pro)含量采用茚三酮顯色法測定[16]。

1.3.4相對電導(dǎo)率和丙二醛含量測定 葉片相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[16]測定；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)顯色法[16]測定。

1.3.5抗氧化酶活性測定 粗酶液的提取，稱取苜蓿幼苗葉片0.5 g放入研缽中，加入液氮研磨組織破碎后加入2 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液和2% PVP(polyvinyl pyrrolidone)充分研磨，然后轉(zhuǎn)入離心管中，用2 mL緩沖液充分清洗研缽，轉(zhuǎn)入離心管中，4℃下15 000 r·min-1離心20 min，所得上清液即為粗酶提取液。將粗酶液分裝入各管中進(jìn)行抗氧化酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量測定。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)采用氮藍(lán)四唑顯色法(nitro blue tetrazolium chloride mono-hydrate,NBT)測定[16]；過氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用紫外比色法測定[16]；過氧化物酶(peroxidase,POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[16]；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate perxidase,APX)活性的測定參照Nakano等[17]的方法。

1.3.6非酶抗氧化物質(zhì)含量測定 粗酶液提取同1.3.5。脫氧抗壞血酸(reduced ascorbic acid,AsA)測定參照J(rèn)in等[18]的方法;氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSH)參照Gossett等[19]的方法測定。

1.3.7內(nèi)源甜菜堿含量和甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)活性測定 內(nèi)源甜菜堿含量測定參照楊雙龍等[20]的方法；BADH酶活性參照Yang等[21]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA進(jìn)行分析處理，Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性方差分析；采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行繪圖與數(shù)據(jù)處理。應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)值法，對各處理紫花苜蓿幼苗與抗寒性相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析。隸屬函數(shù)公式為:

指標(biāo)性狀與抗寒性呈正相關(guān)時，公式為：U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

指標(biāo)性狀與抗寒性呈負(fù)相關(guān)時，公式為：U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，U(Xi)是隸屬函數(shù)值；Xi為某一處理水平某指標(biāo)測定值；Xmax和Xmin為所有參試水平系中某一指標(biāo)中的最大值和最小值。最后將每個處理各抗寒指標(biāo)的隸屬函數(shù)值相加，求出平均值(D值)，進(jìn)行抗寒性排序。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗生長的影響

低溫脅迫抑制了苜蓿幼苗的正常生長，外源甜菜堿濃度為0 mmol·L-1(CK0)時的幼苗株高、根長、地上及地下部分干重均顯著低于CK(P<0.05)，分別為CK的85.65%，71.08%，68.64%和50.40%(圖1)。與CK0相比，葉施30 mmol·L-1的外源甜菜堿時對株高、根長和地上部分干重在低溫脅迫下的緩解作用最強(qiáng)，分別較CK0處理提高了14.16%，33.75%和42.82%；葉施40 mmol·L-1的外源甜菜堿時對地下部分干重脅迫的緩解作用最強(qiáng)，較CK0處理提高69.84%。

與CK0相比，根施30和40 mmol·L-1的外源甜菜堿對株高脅迫的緩解作用最強(qiáng)，較CK0處理提高了10.45%和10.50%；根施40 mmol·L-1的外源甜菜堿對根長脅迫的緩解作用最強(qiáng)，較CK0處理提高了12.30%；根施外源甜菜堿對地上部分干重脅迫的緩解作用和對株高脅迫的緩解作用相似，在外源甜菜堿濃度為30 mmol·L-1和40 mmol·L-1處理時緩解作用最強(qiáng)，較CK0處理提高了32.76%和33.05%；對地下部分干重脅迫的緩解作用隨根施外源甜菜堿濃度增加而逐漸增強(qiáng)，在本試驗(yàn)最大濃度50 mmol·L-1處理時緩解效果最好，較CK0處理提高了82.54%。

圖1 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗生長特性的影響Fig. 1 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on growth characteristics of alfalfa seedlings under low-temperature stress注：同一噴施處理不同濃度下小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同Note:Different lowercase letters in same treatment and different concentrations indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可知，在低溫脅迫下CK0處理的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b含量和葉綠素a/b的值均顯著低于CK(P<0.05)，分別較CK下降了43.01%，38.01%，41.08%和9.32%，說明低溫脅迫抑制了苜蓿幼苗葉片葉綠素的合成和積累。葉施不同濃度甜菜堿時，葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b含量隨甜菜堿濃度的增加呈先升后降的趨勢，在30和40 mmol·L-1的濃度時對低溫抑制的緩解作用最強(qiáng)，較CK0相比，對葉綠素a含量最大提高了34.04%，對葉綠素b含量最大提高了55.66%，對葉綠素a+b含量最大提高了50.96%；對于葉綠素a/b的值隨外源甜菜堿濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)外源甜菜堿濃度為50 mmol·L-1時葉綠素a/b的值達(dá)到最大。

根施外源甜菜堿對低溫脅迫下苜蓿幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b的合成和積累也具有一定促進(jìn)作用，且隨甜菜堿濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，均在50 mmol·L-1處理時達(dá)到最大，分別較CK0提高了49.03%，48.11%和49.43%；對于葉綠素a/b的值隨外源甜菜堿濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)濃度為10和20 mmol·L-1時，由于和CK0相比對葉綠素a的合成與積累有顯著的促進(jìn)作用，而對葉綠素b的影響不顯著，導(dǎo)致葉綠素a/b的值達(dá)各處理最大，且兩濃度處理差異不顯著；當(dāng)濃度為30～50 mmol·L-1時，對葉綠素b的合成與積累作用的增強(qiáng)，使葉綠素a/b的值逐漸降低。

圖2 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗葉綠素含量的影響Fig. 2 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on chlorophyll content of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.3 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖3可知，在CK0處理下，苜蓿幼苗葉片SS和Pro含量分別比CK提高了30.87%和66.60%，與CK差異顯著。葉施甜菜堿時，SS和Pro的含量隨甜菜堿濃度的增加而呈先上升后下降的趨勢，均在40 mmol·L-1處理時達(dá)到最大，分別較CK0提高了53.76%和91.32%。當(dāng)根施外源甜菜堿濃度為20～50 mmol·L-1時，SS和Pro的含量呈逐漸上升趨勢，當(dāng)濃度為50 mmol·L-1時兩種物質(zhì)含量達(dá)到最大，分別比CK0提高了37.37%和77.94%，與CK0差異顯著。

圖3 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig. 3 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on osmotic adjustment substance content of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.4 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗葉片相對膜透性和MDA含量的影響

由圖4可知，與CK0相比，葉施外源甜菜堿可以顯著降低幼苗葉片相對膜透性和MDA含量，并隨外源甜菜堿濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，其中30 mmol·L-1處理時對低溫脅迫的緩解作用最強(qiáng)，分別較CK0降低了23.09%和50.00%。當(dāng)根施外源甜菜堿濃度為20～50 mmol·L-1時，葉片相對膜透性呈逐漸下降的趨勢，當(dāng)濃度為50 mmol·L-1時葉片相對膜透性最低，與CK0相比降低了21.32%；而MDA含量隨外源甜菜堿濃度的增加呈先下降后上升的趨勢，在40 mmol·L-1處理時MDA含量最低，與CK0相比降低了20.00%。

圖4 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量的影響Fig. 4 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on relative conductivity and MDA content of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.5 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響

2.5.1對SOD 活性的影響 葉施和根施外源甜菜堿處理的葉片SOD活性均顯著高于CK0，說明10～50 mmol·L-1的甜菜堿可以促進(jìn)葉片SOD活性，減少活性氧損傷，增強(qiáng)抗氧化能力，兩種外施方式下葉片SOD活性隨外源甜菜堿濃度的增加而均呈先上升后下降的趨勢，其中葉施20 mmol·L-1和30 mmol·L-1的甜菜堿時SOD活性最大，與CK0處理相比，分別提高了104.15%和115.81%；對根施而言，30 mmol·L-1和40 mmol·L-1的甜菜堿處理時SOD活性最大，與CK0處理相比，分別提高了52.87%和51.75% (圖5)。

2.5.2對POD活性的影響 與CK0相比，葉施和根施外源甜菜堿處理均顯著提高了低溫脅迫下葉片POD活性，說明外源甜菜堿可以通過增強(qiáng)葉片POD活性提高苜蓿幼苗抗氧化能力，緩解低溫冷害損傷。葉施30 mmol·L-1和40 mmol·L-1的甜菜堿時POD活性最大，與CK0處理相比，分別提高了50.38%和51.17%；根施40 mmol·L-1和50 mmol·L-1的甜菜堿處理時POD活性最大，與CK0處理相比，分別提高了28.20%和25.78% (圖5)。

2.5.3對CAT活性的影響 由圖5可知，葉施外源甜菜堿時CAT活性隨濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在40 mmol·L-1的處理時活性最強(qiáng)，與CK0相比提高了374.38%；根施40 mmol·L-1和50 mmol·L-1的甜菜堿時CAT活性最強(qiáng)，較CK0提高了263.75%和264.38%。

2.5.4對APX活性的影響 由圖5可知，CK0處理與CK相比，幼苗葉片APX活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)。與CK0相比，葉施和根施不同濃度甜菜堿均使幼苗葉片APX活性顯著增強(qiáng)。葉施外源甜菜堿時APX活性隨濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在40 mmol·L-1的處理時活性最強(qiáng)，與CK0相比提高了38.73%；根施外源甜菜堿時APX活性呈逐漸上升的趨勢，在40 mmol·L-1的處理時活性最強(qiáng)，與CK0相比提高了28.87%。

圖5 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響Fig. 5 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on antioxidant enzyme activity of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.6 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗還原性抗壞血酸(AsA)和還原性谷胱甘肽(GSH)的影響

由圖6可知，葉施外源甜菜堿時AsA和GSH含量隨濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，均在40 mmol·L-1的處理時達(dá)到最大值，兩種物質(zhì)含量較CK0分別提高了85.02%和33.47%；根施外源甜菜堿時AsA和GSH含量隨濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，均在50 mmol·L-1的處理時達(dá)到最大值，兩種物質(zhì)含量較CK0分別提高了61.53%和29.32%。

圖6 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗AsA和GSH含量的影響Fig. 6 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on AsA and GSH contents of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.7 低溫脅迫下外源甜菜堿對紫花苜蓿幼苗內(nèi)源甜菜堿積累的影響

2.7.1對甜菜堿含量的影響 由圖7可知，葉施外源甜菜堿時內(nèi)源甜菜堿含量隨濃度的增加呈先上升后下降的趨勢，在40 mmol·L-1的處理時含量最高，與CK0相比提高了6.99倍；根施外源甜菜堿時內(nèi)源甜菜堿含量隨濃度的增加呈逐漸上升的趨勢，在50 mmol·L-1的處理時含量最高，與CK0相比提高了3.21倍。

2.7.2對BADH活性的影響 由圖7可知，CK0處理下苜蓿幼苗葉片的BADH活性與CK差異不顯著。而葉施和根施不同濃度的外源甜菜堿對苜蓿幼苗葉片的BADH活性均有提高，且變化趨勢與內(nèi)源甜菜堿含量的變化基本一致。葉施40 mmol·L-1外源甜菜堿時BADH活性最高，與CK0相比提高了55.65%；根施外源甜菜堿以50 mmol·L-1的處理時活性最高，此時葉片BADH活性比CK0提高了15.32%。

圖7 不同濃度外源甜菜堿對低溫脅迫下紫花苜蓿幼苗內(nèi)源甜菜堿含量和BADH活性的影響Fig. 7 Effects of exogenous glycine betaine with different concentrations on endogenous glycine betaine content and BADH activity of alfalfa seedlings under low-temperature stress

2.8 隸屬函數(shù)均值抗寒性分析

采用模糊隸屬函數(shù)法對所測的19個生理指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算分析，綜合評價不同施加方式和不同濃度甜菜堿處理緩解低溫脅迫的能力。如表1所示，葉施外源甜菜堿對緩解低溫脅迫的能力為30 mmol·L-1>40 mmol·L-1>50 mmol·L-1>20 mmol·L-1>10 mmol·L-1>0 mmol·L-1；根施外源甜菜堿對緩解低溫脅迫的能力為40 mmol·L-1>50 mmol·L-1>30 mmol·L-1>20 mmol·L-1>10 mmol·L-1>0 mmol·L-1。由此可知，葉施30 mmol·L-1和根施40 mmol·L-1的外源甜菜堿對緩解苜蓿幼苗低溫脅迫的效果最佳。

表1 抗寒指標(biāo)隸屬函數(shù)值及綜合評價Table 1 Subordinate function value and comprehensive evaluation of chilling resistance index

3 討論

溫度是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一，低溫脅迫會抑制植物株高、根長及生物量的積累[22]。楊德光等對玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對玉米幼苗株高、根長、地上和地下生物量均有影響[23]。陳勝萍等研究發(fā)現(xiàn)，番茄幼苗株高、莖粗、根長、干物質(zhì)4個生長指標(biāo)隨溫度的降低而減少[24]。葉和根是植物光合作用和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)闹饕鞴伲梢姷蜏孛{迫會造成各植物器官發(fā)育延緩，植物代謝速度降低，光合速率下降，進(jìn)而影響生物量的積累。本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫明顯抑制了苜蓿幼苗的生長，且經(jīng)低溫處理的幼苗，其株高、根長及地上和地下部分干重均顯著低于正常水平下生長的幼苗。葉施和根施外源甜菜堿對低溫脅迫下幼苗株高、根長及地上和地下部分干重均有明顯增加，說明外源甜菜堿能夠緩解低溫脅迫對幼苗生長的抑制作用。這與前人研究表明施加外源甜菜堿可以顯著緩解低溫脅迫對植物的傷害，增加植物株高、根長及生物量的結(jié)果一致[25-26]。這可能是由于甜菜堿提高了葉片光合作用效率和新陳代謝強(qiáng)度，從而緩解了低溫脅迫對生物量積累的抑制作用。

光合作用是植物最基本且最重要的代謝過程，是植物合成有機(jī)質(zhì)和轉(zhuǎn)化能源的根本途徑，它對植物生長及其抗逆性都具有十分重要的意義。葉綠素是植物光合作用中最重要的物質(zhì)之一，也是反映葉片損傷程度最直接的指標(biāo)之一[27]。崔翠等研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后烤煙幼苗葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量均顯著下降，光合能力降低，導(dǎo)致凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率等顯著下降，并且多數(shù)葉綠素相關(guān)基因處于下調(diào)[28]。王寧等研究發(fā)現(xiàn)，溫度急劇下降時，葉綠素合成受到阻礙，光合色素和葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致樟樹葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量快速下降[29]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，低溫脅迫下苜蓿幼苗葉綠素a、葉綠素b及葉綠素a+b含量和葉綠素a/b的值均顯著低于對照。研究表明，甜菜堿在葉綠體中含量較為豐富，可以在逆境脅迫下保護(hù)類囊體膜結(jié)構(gòu)，維持光系統(tǒng)Ⅱ復(fù)合體蛋白的穩(wěn)定性，從而保持較高的光合速率[30-31]。此外，甜菜堿還能維持逆境條件下植物葉綠體體積，增加葉綠素a/b的值，降低類胡蘿卜素和葉綠素的比值，保持Ca2+-ATPase活性和希爾反應(yīng)活力，以維持植物的光合能力[32-33]。梁小紅等研究發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下通過外施100 mmol·L-1的外源甜菜堿可以阻止結(jié)縷草葉綠素含量的下降，緩解低溫脅迫對植物光合作用的抑制[34]。本試驗(yàn)中，葉施30，40 mmol·L-1和根施50 mmol·L-1外源甜菜堿能顯著緩解低溫脅迫下苜蓿幼苗葉綠素含量的降低，說明外源甜菜堿可以保護(hù)苜蓿葉綠體結(jié)構(gòu)不受低溫?fù)p傷，從而使苜蓿幼苗的葉綠素含量保持較高水平。

SS和Pro是植物體內(nèi)兩種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，低溫脅迫下，植物體內(nèi)SS和Pro含量增加，從而提高了細(xì)胞內(nèi)束縛水的含量，增大了胞液濃度，降低胞液滲透壓，防止細(xì)胞因脫水而死亡，減緩低溫脅迫對植物的損傷[35]。徐錦海等研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后水稻幼苗SS和Pro含量顯著下降，但經(jīng)外源甜菜堿處理后幼苗體內(nèi)SS和Pro含量得到顯著提高，緩解了低溫脅迫對幼苗造成的傷害[36]。本研究也表明，低溫脅迫顯著增加了苜蓿的SS和Pro含量，并且葉施和根施外源甜菜堿可以進(jìn)一步增加這兩種物質(zhì)的含量，說明外源甜菜堿能夠增強(qiáng)苜蓿幼苗的抗寒能力。這可能是由于外源甜菜堿提高了SS和Pro合成途徑中關(guān)鍵酶的活性，促進(jìn)SS和Pro的合成，增強(qiáng)了苜蓿幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。植物細(xì)胞膜系統(tǒng)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換的重要部位，也是感受低溫脅迫最敏感的部位[37]。相對膜透性和MDA含量是反映細(xì)胞膜系統(tǒng)受到傷害程度和膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)[38-39]。本研究表明，低溫脅迫下苜蓿幼苗葉片相對膜透性和MDA含量較CK處理顯著增加，說明低溫脅迫加快了膜脂過氧化程度，破壞了苜蓿葉片的細(xì)胞膜系統(tǒng)。甜菜堿不僅是一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它還起到防止細(xì)胞膜的熱變形，降低原生質(zhì)膜由液晶相變?yōu)槟z相的溫度，穩(wěn)定膜系統(tǒng)完整性的作用[40]。李蕓瑛[41]以黃瓜為材料，探究了外源甜菜堿對幼苗抗冷性的影響，結(jié)果表明外源甜菜堿處理幼苗可以緩解相對膜透性的增加，抑制MDA合成，通過防止膜脂過氧化加劇，保護(hù)了細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而提高黃瓜幼苗抗冷能力。本研究表明，低溫脅迫下葉施和根施外源甜菜堿可以顯著降低苜蓿的相對膜透性和MDA含量，說明外源甜菜堿能夠緩解膜脂過氧化反應(yīng)，保證了苜蓿細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性和完整性，從而提高了苜?？购?。

逆境脅迫下，植物內(nèi)源甜菜堿的積累對于細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要。目前，植物內(nèi)源甜菜堿的積累主要有三種途徑：一是在干旱、鹽以及低溫脅迫下誘導(dǎo)植物內(nèi)源甜菜堿的積累[53]；二是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將甜菜堿合成關(guān)鍵酶基因(如BADH基因)導(dǎo)入植物體內(nèi)，是植物具備合成內(nèi)源甜菜堿的能力[11]；三是通過化學(xué)誘導(dǎo)劑，如通過葉施或根施外源甜菜堿誘導(dǎo)植物內(nèi)源甜菜堿的合成與積累[12]。李茂福等研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫和外源甜菜堿均可以誘導(dǎo)香蕉內(nèi)源甜菜堿的積累，而外源甜菜堿的誘導(dǎo)效應(yīng)更加顯著[54]。本研究結(jié)果表明，僅低溫脅迫對苜蓿內(nèi)源甜菜堿的積累無顯著的誘導(dǎo)效果，這可能是由于苜蓿品種差異或自身甜菜堿合成途徑較少所導(dǎo)致；而葉施和根施外源甜菜堿可以顯著提高苜蓿內(nèi)源甜菜堿含量，這可能是因?yàn)橥庠刺鸩藟A能被迅速轉(zhuǎn)移到植物各組織器官中，導(dǎo)致苜蓿內(nèi)源甜菜堿的積累。甜菜堿醛脫氫酶(BADH)是植物內(nèi)源甜菜堿合成的關(guān)鍵酶之一[7]，植物內(nèi)源甜菜堿的合成主要是在葉綠體中進(jìn)行，而BADH主要分布在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中[55]。BADH酶活性受逆境脅迫誘導(dǎo)顯著，有學(xué)者認(rèn)為調(diào)控BADH的基因可能有兩種，即誘導(dǎo)型和組成型，并且在海欖雌中發(fā)現(xiàn)這兩種不同的BADH基因[56]。也有研究報道，低溫脅迫下外源甜菜堿對香蕉葉片內(nèi)源甜菜堿的積累主要不是通過滲透，而是通過誘導(dǎo)BADH活性促進(jìn)葉片內(nèi)源甜菜堿的合成與積累[57]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉施外源甜菜堿可以有效提高BADH活性，并且其變化趨勢和內(nèi)源甜菜堿含量基本一致；而根施外源甜菜堿雖然也可以提高BADH活性，但提升幅度低于葉施處理。這可能是因?yàn)槿~施時外源甜菜堿更易被轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體中，促進(jìn)了BADH活性，從而提高了內(nèi)源甜菜堿的合成與積累；而根施時，外源甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)到葉綠體的過程較為緩慢且存在損失，因此導(dǎo)致BADH活性和內(nèi)源甜菜堿含量均低于葉施處理。

4 結(jié)論

本研究表明，葉施和根施外源甜菜堿均能有效緩解低溫脅迫下苜蓿幼苗株高、根長、地上及地下生物量和葉綠素含量的降低，增加可溶性糖(SS)和游離脯氨酸(Pro)的含量，減少葉片相對膜透性和MDA含量的升高，顯著提高SOD、POD、CAT和APX的活性以及AsA、GSH含量，并促進(jìn)了苜蓿幼苗內(nèi)源甜菜堿的積累和BADH酶活性，緩解了低溫脅迫對苜蓿幼苗光合作用的抑制，增強(qiáng)了滲透調(diào)節(jié)能力，保護(hù)了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，提高了抗氧化代謝能力，進(jìn)而提高苜蓿幼苗對低溫脅迫的抗性。其中，葉施30 mmol·L-1和根施40 mmol·L-1的外源甜菜堿對緩解苜蓿幼苗低溫脅迫的效果最佳。