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    小腸黏膜下層與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程血管

    2019-04-16 03:09:12王飛
    關(guān)鍵詞:下層培養(yǎng)液小腸

    王飛

    (邯鄲市中心醫(yī)院關(guān)節(jié)外科, 邯鄲, 056001)

    目前,全世界每年約有20 萬例周圍血管移植手術(shù),自體血管移植是目前最為理想的血管替代物,但自體血管材料來源有限,且血管內(nèi)徑的匹配在移植方面也受限制[1]。隨后有學(xué)者提出采用同種異體血管及組織工程血管來代替自體血管,但同種異體血管移植后會(huì)出現(xiàn)漸進(jìn)性的血管變性及增生異常,導(dǎo)致血管狹窄或閉塞從而使移植失敗[2]。因此,人們把研究方向放在組織工程血管上。

    小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì),可通過機(jī)械方法除去小腸肌層和黏膜層,從而獲得一種半透明的膠原基質(zhì),處理后的SIS 主要由Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白構(gòu)成,并含少量Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白,是一種不含細(xì)胞的基質(zhì)材料,由于其具有較好的生物相容性、無免疫原性、可促進(jìn)組織再生、在體降解速度快和機(jī)械強(qiáng)度高等特性,在組織工程材料方面受到廣泛關(guān)注[3]。本實(shí)驗(yàn)主要目的是應(yīng)用SIS 構(gòu)建組織工程血管支架,并對(duì)其復(fù)合內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分析,從而為制備組織工程血管提供前期準(zhǔn)備。

    材料與方法

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    本實(shí)驗(yàn)于2016 年04 月至2017 年04 月在河北省邯鄲市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)選取5 ~6 月齡家豬,取新鮮空腸作為制備SIS 材料,無菌條件取下肢大隱靜脈備用。

    2 主要試劑

    乙二胺四乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、過氧乙酸和乙醇購自北京化學(xué)試劑有限公司;磷酸緩沖鹽溶液和Hoechst33258 購自Solarbio 公司;FDA/PI 購自美國Sigma 公司;鼠來源層粘連蛋白(laminin)抗體和兔來源纖維連接蛋白(fibronectin)抗體購自英國Abcam 公司;山羊抗小鼠IgG/Alexa ?488 和山羊抗兔IgG/TRITC 購自中山金橋生物技術(shù)有限公司;DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基購自康寧公司;100×青霉素/鏈霉素雙抗溶液購自美國Hyclone 公司;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程有限公司。

    3 小腸黏膜下層的制備及去抗原性

    用生理鹽水反復(fù)沖洗新鮮豬空腸后用無菌帶齒鑷撕下空腸外面的漿膜層、肌層,然后翻轉(zhuǎn)空腸,撕下內(nèi)側(cè)的黏膜層,剩下的組織即為SIS。

    將制備好的SIS 膜放入乙二胺四乙酸(100mmol/L)和氫氧化鈉(10mmol/L)的混合溶液中浸潤16h,取出后無菌蒸餾水反復(fù)沖洗,隨后放入鹽酸(1mmol/L)和氯化鈉(1mmol/L)的混合溶液中浸潤8h,取出后無菌蒸餾水再次反復(fù)沖洗。放入PBS 中浸潤16h,再次用無菌蒸餾水反復(fù)沖洗。隨后放入過氧乙酸(0.1%)和乙醇(20%)的混合溶液中浸潤8h,用含0.05%三氮化鈉的磷酸緩沖鹽溶液反復(fù)沖洗。將制備好的SIS 冷凍干燥后150Gyγ射線輻照消毒備用。

    4 層粘連蛋白和纖維連接蛋白免疫熒光染色

    將制備成功的SIS 冰凍切片,丙酮固定后PBS液體洗3 次,3%過氧化氫中避光20min,再次PBS洗3 次后取鼠來源Laminin 抗體和兔來源Fibronectin 抗體各1μl 加入198μl PBS 液中,4℃條件下過夜,隨后加入山羊抗小鼠IgG/Alexa ?488 和山羊抗兔IgG/TRITC,避光孵育2h,熒光顯微鏡下觀察并記錄。

    5 大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與擴(kuò)增

    無菌條件下切取新鮮豬大隱靜脈,將其浸入含肝素的生理鹽水中反復(fù)沖洗靜脈內(nèi)殘留的血液,隨后用含低分子肝素鈉生理鹽水再次反復(fù)沖洗,直至流出液體清亮為止。用5ml 注射器將約5ml 的0.1%Ⅱ型膠原酶自靜脈的一端注入,管腔充盈后用止血鉗夾住血管兩端,消化30min,隨后用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗數(shù)次,以終止消化,并將沖洗液和消化液一同收集入離心管中,以1500r/min 離心3min,棄上清液,再次用含5%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液沖洗、離心、棄上清液。用含10%胎牛血清、1mg/L 堿性成纖維細(xì)胞生長因子、1mg/L 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的DMEM/F12 培養(yǎng)液沖洗后植入培養(yǎng)瓶中,加入雙抗(青霉素及鏈霉素)10μl。于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,細(xì)胞貼壁后換液,待細(xì)胞生長達(dá)80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

    6 細(xì)胞接種及復(fù)合培養(yǎng)

    小腸黏膜下層于培養(yǎng)液中浸泡20min 后平鋪于6 孔板中,取第3 代生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,PBS 液體洗3 次后加入0.25%胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)后以1×105/cm2的密度接種于小腸黏膜下層材料表面,成功構(gòu)建小腸黏膜下層與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合體,加入適量含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)中培養(yǎng)24h。

    7 Hoechst33258 染色

    將25μg/mL 的Hoechst33258 分別加入至無細(xì)胞接種的SIS 和細(xì)胞接種后的SIS 表面,,常溫孵育5min,丙三醇處理后熒光顯微鏡觀察并記錄。

    8 FDA/PI 染色觀察

    將六孔板中培養(yǎng)液吸出,向每孔中加入FDA(15μg/mL)80μl 侵染5min,PBS 漂洗,再加入PI(15μg/mL)80μl 侵染5min,PBS 再次漂洗,熒光顯微鏡觀察并記錄。

    結(jié) 果

    1 體外培養(yǎng)的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好

    倒置相差顯微鏡下觀察,第三代貼壁生長的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞多呈小三角形,互相鑲嵌排列,細(xì)胞融合達(dá)80%左右,生長狀態(tài)良好(圖1)。

    圖1 體外培養(yǎng)大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)正常。比例尺,100μmFig. 1 The morphology of vascular endothelial cells isolated from porcine greatporcine great saphenous vein and cultured in vitro was normal. Scale bar,100μm

    2 小腸黏膜下層中的層黏連蛋白及纖維連接蛋白表達(dá)豐富

    免疫熒光染色結(jié)果顯示,SIS 中含有較高水平的層黏連蛋白(圖2A)及纖維連接蛋白(圖2B)表達(dá)。

    圖2 小腸黏膜下層中的層黏連蛋白(A)及纖維連接蛋白(B)的表達(dá)豐富。比例尺,5000μmFig. 2 High expression of laminin (A) and fibronectin (B) in SIS . Scale bar, 5000μm

    3 Hoechst33258 染色顯示內(nèi)皮細(xì)胞種植于小腸黏膜下層后的存活數(shù)量大

    Hoechst33258 染色結(jié)果顯示,接種前的SIS 未見明顯細(xì)胞核著色,只有深藍(lán)色背景(圖3A),而在體外培養(yǎng)的大隱靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于SIS 之后,在深藍(lán)色背景上可見數(shù)量較多的呈亮藍(lán)色的細(xì)胞核(圖3B)。

    4 FDA/PI 熒光染色顯示種植于小腸黏膜下層支架上的內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好

    FDA/PI 熒光染色結(jié)果顯示,在SIS 材料上可見大量呈綠色熒光的活細(xì)胞,以及少量呈紅色熒光的死細(xì)胞,它們均勻分布,表明內(nèi)皮細(xì)胞于SIS 支架上生長狀態(tài)良好(圖4)。

    討 論

    以自體血管移植手術(shù)這種以創(chuàng)傷修復(fù)創(chuàng)傷的辦法加重了患者的痛苦與損傷[4],且由于自體靜脈與動(dòng)脈在結(jié)構(gòu)上存在差異,長度、內(nèi)徑匹配的自體血管有限,以及靜脈本身病變率較高等缺點(diǎn),嚴(yán)重限制自體血管的臨床應(yīng)用[1]。

    圖3 小腸黏膜下層接種內(nèi)皮細(xì)胞前后的生長狀態(tài)比較。A.內(nèi)皮細(xì)胞種植前無活細(xì)胞;B.內(nèi)皮細(xì)胞種植后可見大量存活細(xì)胞。比例尺,200μmFig. 3 The observation of the growth state of SIS before and after endothelial cells inoculation. A. no viable cells before endothelial cell inoculation; B.a large number of surviving cells after endothelial cell inoculation; scale bar, 200μm

    圖4 小腸黏膜下層支架上內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好。比例尺,200μmFig. 4 The good growth state of endothelial cells on SIS stent. Scale bar, 200μm

    小腸黏膜下層為一種天然無免疫原性的細(xì)胞外基質(zhì)材料,并且含有多種細(xì)胞生長因子,如血管生長因子(VEGF)、上皮細(xì)胞生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)、顆粒酶B、轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長因子 β、硫酸蛋白多糖、肝細(xì)胞生長因子、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等[5],已被廣泛應(yīng)用于異基因組織工程支架的構(gòu)建。FGF-2 可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖與遷移,創(chuàng)造血管再生的條件[6]。Hang 等人研究表明SIS 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu),其作用與應(yīng)用VEGF 相似,從而間接表明SIS 中含有VEGF[7]。Hendel 等人研究表明SIS 中的顆粒酶B 可釋放血管內(nèi)皮生長因子并誘導(dǎo)血管通透性[8]。通過機(jī)械方法制備的SIS 具有三維立體結(jié)構(gòu),孔隙率約60%,可促進(jìn)細(xì)胞黏附和增殖,其具有的機(jī)械強(qiáng)度可有力支撐新生組織[9]。SIS 在皮膚[10]、骨膜[11]、神經(jīng)[9]、膀胱[12,13]、聲帶[14]等組織工程構(gòu)建中已顯示出較好的生物相容性,機(jī)械強(qiáng)度高,無免疫原性,抗微生物活性,以及部位特異的組織再生能力等特性,滿足了組織工程血管的基本要求,在血管組織工程支架材料研究中日益受到重視。

    我們使用機(jī)械法制備豬空腸的SIS,隨后去除SIS 上的殘留細(xì)胞,使其成為具有三維立體結(jié)構(gòu)的天然細(xì)胞外基質(zhì)。相關(guān)研究表明,SIS 經(jīng)過制備處理后仍含有前述的多種細(xì)胞生長因子[15]。我們也證明SIS 上含有豐富的層粘連蛋白和纖維連接蛋白,纖維連接蛋白含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸序列,可以特異性結(jié)合細(xì)胞膜受體,從而促進(jìn)細(xì)胞粘附;層粘連蛋白也具有促進(jìn)細(xì)胞粘附的作用。內(nèi)皮細(xì)胞接種于SIS 上后,細(xì)胞存活數(shù)量較多,分布比較均勻,內(nèi)皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好,這得益于SIS 上含有較多的層粘連蛋白和纖維連接蛋白,從而也說明了SIS 對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞具有較好的生物相容性。

    通過研究SIS 體外擬生態(tài)環(huán)境下與內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)以探索構(gòu)建組織工程血管臨床應(yīng)用的可行性,本實(shí)驗(yàn)表明內(nèi)皮細(xì)胞和SIS 復(fù)合培養(yǎng)后的生長狀態(tài)良好,具有較好的生物相容性,同時(shí)相關(guān)研究也表明SIS 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀結(jié)構(gòu)[3],故SIS 具有構(gòu)建組織工程血管的能力,可行性較高。另外,豬SIS 基質(zhì)制備方便,價(jià)格低廉,來源穩(wěn)定,為理想的組織工程血管材料。

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