stomatin對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)及定位的影響△

劉明依，安華英，袁偉#，馬潔2國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京0002

2北京醫(yī)院生物治療中心/國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心，北京100730 0

stomatin蛋白是一種單向、低聚合的脂筏相關(guān)蛋白，也稱作band 7.2b。該蛋白組織細(xì)胞膜的膽固醇依賴性調(diào)節(jié)過(guò)程，并參與調(diào)節(jié)離子通道的生理過(guò)程，最初是在研究遺傳性口形紅細(xì)胞增多癥（一種溶血性貧血）病因時(shí)從正常人紅細(xì)胞質(zhì)膜中被分離出來(lái)[1-3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)stomatin在多種惡性腫瘤中的表達(dá)異常，提示其可能參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Montel-Hagen等[4]發(fā)現(xiàn)在少數(shù)無(wú)法合成維生素C的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞膜中，stomatin能夠與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）相互作用，影響Glut1的葡萄糖吸收速率。Glut1是Glut家族的首要成員，存在于多種正常組織中（腦和紅細(xì)胞中存在豐富，動(dòng)物脂肪、肌肉、肝臟、胰腺中表達(dá)量一般）[5]?，F(xiàn)階段普遍認(rèn)為在主要組織中，Glut1起到主要的葡萄糖攝取功能。據(jù)研究Glut1已被證明是惡性腫瘤細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵限速因子，在不同類型的人類腫瘤中過(guò)度表達(dá)，如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌和結(jié)直腸癌等[6-10]。stomatin與Glut1相互作用關(guān)系的改變可以影響葡萄糖攝取的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究對(duì)stomatin與Glut1的相互作用進(jìn)行探究，以證實(shí)stomatin基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞中Glut1表達(dá)及定位的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肺鱗癌細(xì)胞系H520購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心。

1.2 主要試劑和儀器

PRMI 1640培養(yǎng)基、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；F12K培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco life technology公司；stomatin、Glut1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；LipofectamineTM2000試劑盒、Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG、Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；過(guò)表達(dá)stomatin基因慢病毒、病毒感染試劑HitransG P購(gòu)自中國(guó)吉?jiǎng)P基因公司；普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自中國(guó)天根生化科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自日本Takara公司；ribo-FECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自中國(guó)銳博生物公司；PE anti-DYKDDDDK流式抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。正置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton-Dickinson公司，ELX800酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-TEK Instrument公司，Image QuantTMLAS 4000數(shù)字成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare Life Sciences公司，激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Leica Microsystems公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放入含10%BSA的F12K培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；人肺鱗癌細(xì)胞系H520放入含10%BSA的PRMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.2 stomatin siRNA轉(zhuǎn)染A549、 H520細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、H520細(xì)胞，分別以2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。待達(dá)到40%～60%融合度時(shí)，按照riboFECTTMCP轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染stomatin siRNA下文以A549sistom、H520-sistom表示，轉(zhuǎn)染control siRNA下文以A549sinc、H520sinc表示。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)stomatin蛋白及Glut 1蛋白表達(dá) 提取A549sinc、A549sistom、H520sinc、H520sistom細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，200 mA恒定電流轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶4℃封閉過(guò)夜。stomatin、Glut1抗體（均1∶1000稀釋）和內(nèi)參β-actin抗體（1∶3000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠抗體和羊抗兔抗體（1∶3000稀釋），室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色并曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)stomatin及Glut 1基因表達(dá)情況 以Trizol法提取 A549sinc、A549sistom、H520sinc、H520sistom細(xì)胞的總RNA，提取方法參見說(shuō)明書。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè) stomatin、Glut1基因表達(dá)情況，反應(yīng)條件參見SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說(shuō)明書，其中擴(kuò)增溫度分別為57℃和63℃，選取 β-actin 為內(nèi)參基因，采用 2-△△Ct方法計(jì)算。stomatin基因的正向引物序列為5'-CACACACGGGACTCCGAAG-3'，反向引物序列為5'-ATGAGAACGCCACCAAAATCC-3'；Glut1基因的正向引物序列為5'-GGCCAAGAGTGTGCTAAAGAA-3'，反向引物序列為5'-ACGCGTTGATGCCAGACAG-3'。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 細(xì)胞免疫熒光染色 取stomatin siRNA轉(zhuǎn)染24 h后的A549、H520細(xì)胞，以1×105/孔加入至24孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，3%甲醛和2%蔗糖溶液固定15 min，0.1 mmol/L甘氨酸室溫孵育5 min，1%BSA室溫封閉2 h以上。加入stomatin與Glut1混合抗體稀釋液，室溫孵育3 h，PBS洗滌，加入二抗稀釋液，室溫避光孵育 1 h，PBS洗滌，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，封片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 慢病毒感染A549、H520細(xì)胞構(gòu)建過(guò)表達(dá)stomatin基因細(xì)胞系 以1.5×105/孔將細(xì)胞接種于24孔板，使用相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。感染前使用完全培養(yǎng)基1∶25稀釋病毒感染試劑HitransG P，并替代舊培養(yǎng)基。24孔板每孔500 μl。根據(jù)細(xì)胞感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值加入相應(yīng)病毒使用量，MOIA549=10，MOIH520=50。

1.3.7 3×flag-Glut 1-PcDNA 3.1（-）質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 A549、 H520細(xì)胞在Glut1的第一個(gè)細(xì)胞外段序列中插入3個(gè)連續(xù)的flag標(biāo)簽。選取PcDNA3.1（-）作為載體，利用酶切、連接技術(shù)將含有flag標(biāo)簽的Glut1序列插入其中，構(gòu)建完成3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質(zhì)粒。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)stomatin的A549、H520細(xì)胞，分別以2×105/孔接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h。待達(dá)到60%～80%融合度時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染 PcDNA3.1（-）質(zhì)粒。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Glut 1細(xì)胞內(nèi)定位情況將完成 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）轉(zhuǎn)染的 A549、H520細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入PE anti-DYKDDDDK抗體4℃孵育30 min，PBS洗滌，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌細(xì)胞 A549、H520中敲降stomatin表達(dá)對(duì)Glut 1表達(dá)的影響

利用siRNA敲降A(chǔ)549、H520細(xì)胞中的stomatin基因，qRT-PCR結(jié)果顯示，與A549sinc相比，stomatin敲降后的A549細(xì)胞中stomatin的mRNA表達(dá)量變化為（0.14±0.11）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.860，P﹤0.01）；Glut1的 mRNA 表達(dá)量變化為（0.93±0.33）倍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.371，P﹥0.05）。與H520sinc相比，stomatin敲降后的H520細(xì)胞中stomatin的mRNA表達(dá)量變化為（0.07±0.03）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=46.500，P﹤0.01）；Glut1的mRNA表達(dá)量變化為（0.92±0.34）倍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.386，P﹥0.05）。Western blot結(jié)果顯示，敲降stomatin后，A549及H520細(xì)胞中stomatin的蛋白表達(dá)量降低，而Glut1的蛋白表達(dá)量不變（圖1）。

2.2 肺癌細(xì)胞 A549、H520中敲降stomatin表達(dá)對(duì)Glut 1蛋白表達(dá)位置的影響

圖1 Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 A549、 H520細(xì)胞中stomatin蛋白及Glut 1蛋白的表達(dá)情況

stomatin siRNA 轉(zhuǎn)染 A549、H520細(xì)胞后，對(duì)A549、H520兩種細(xì)胞的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的stomatin、Glut1蛋白和細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，結(jié)果顯示，stomatin與Glut1存在緊密的共定位情況。與A549sinc相比，A549sistom中Glut1蛋白的主要表達(dá)位置由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；H520細(xì)胞中stomatin與Glut1蛋白的表達(dá)雖未及A549細(xì)胞明顯，但呈現(xiàn)一致的Glut1轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。（圖2）

2.3 肺癌細(xì)胞 A549、H520中stomatin的過(guò)表達(dá)對(duì)Glut 1蛋白表達(dá)位置的影響

圖2 細(xì)胞免疫熒光染色顯示肺癌細(xì)胞 A549、 H520中敲降stomatine表達(dá)對(duì)Glut 1蛋白表達(dá)位置的影響（×630）

為了檢測(cè)Glut1在細(xì)胞膜上表達(dá)的變化，本研究在Glut1蛋白的第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)上插入flag標(biāo)簽，構(gòu)建 3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質(zhì)粒。向過(guò)表達(dá)stomatin的A549、H520細(xì)胞中導(dǎo)入3×flag-Glut1-PcDNA3.1（-）質(zhì)粒，流式抗體識(shí)別flag標(biāo)簽檢測(cè)Glut1蛋白在細(xì)胞膜的表達(dá)情況。stomatin過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞中3×flag-Glut1在細(xì)胞膜的表達(dá)率為（1.30±0.13）%，明顯高于對(duì)照組A549細(xì)胞的（0.53±0.23）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.690，P﹤0.01）；stomatin過(guò)表達(dá)的H520細(xì)胞中3×flag-Glut1在細(xì)胞膜的表達(dá)率為（24.07±0.83）%，明顯高于對(duì)照組H520細(xì)胞的（20.17±0.93）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.414，P﹤0.01）。

3 討論

Glut1是Glut家族的首要成員，已被證明是惡性腫瘤細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵限速因子，并在不同類型的人類腫瘤中過(guò)度表達(dá)。大量的研究表明，Glut1參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，Glut1的過(guò)度表達(dá)與血管浸潤(rùn)、微血管密度和腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)[11]。

作為腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖的關(guān)鍵載體，Glut1主要分布在細(xì)胞膜，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也存在富含Glut1的囊泡，但只有細(xì)胞膜表面的Glut1增多時(shí)，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量才能增加。早在1995年，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-3（interleukin-3，IL-3）和激酶的激活通過(guò)促進(jìn)Glut1向細(xì)胞表面的易位來(lái)刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[12]。由生長(zhǎng)因子或致癌基因調(diào)控的Glut1轉(zhuǎn)位可能在抑制造血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡中起重要作用。而后的研究表明，IL-3能夠使磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）活化進(jìn)而激活蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT），通過(guò)RAB11A依賴的細(xì)胞內(nèi)蛋白循環(huán)使得Glut1能夠在細(xì)胞膜上表達(dá)[5]。不只是PI3K/PKB信號(hào)通路對(duì)Glut1轉(zhuǎn)位進(jìn)行調(diào)控，TP53的相關(guān)通路也起到了一定作用。腫瘤相關(guān)突變的p53可以激活Warburg效應(yīng)。這種激活Warburg效應(yīng)的機(jī)制為通過(guò)激活Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）和其下游效應(yīng)器Rho激酶（Rho-associated coiled-coil-forming kinase，ROCK），促進(jìn)Glut1轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上。在饑餓和壓力環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)自噬反應(yīng)，通過(guò)增加細(xì)胞表面Glut1的表達(dá)促進(jìn)葡萄糖的攝取和糖酵解的流向[13]。有報(bào)道指出，在代謝壓力下，表達(dá)微管相關(guān)蛋白輕鏈3陽(yáng)性（light chain 3，LC3）的自噬泡與Retromer復(fù)合體結(jié)合從而隔斷自噬泡與TBC1域家族成員 5（TBC1 domain family member 5，TBC1D5）的結(jié)合，將其招募到內(nèi)含體膜上形成Glut1的轉(zhuǎn)位。因此在代謝壓力引起的自噬中，TBC1D5能夠關(guān)閉Retromer依賴的Glut1轉(zhuǎn)位，以保證Glut1在細(xì)胞膜上的表達(dá)，維持葡萄糖的攝取[14]。雖然目前科學(xué)家們對(duì)Glut1的轉(zhuǎn)位調(diào)控進(jìn)行了一些信號(hào)通路相關(guān)研究，但是具體的調(diào)控機(jī)制還有待研究。

本研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、H520中stomatin與Glut1之間的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了探究。首先通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低stomatin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在A549、H520細(xì)胞中stomatin表達(dá)的降低并不影響Glut1的表達(dá)。Kumar等[15]檢測(cè)了在正常的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，Glut1在Triton X-100可溶性和不溶性部分中的分布，幾乎90%的細(xì)胞膜池中的stomatin都是耐洗滌劑的脂筏，該研究結(jié)果顯示在正常的3T3-L1脂肪細(xì)胞中，無(wú)法在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中證明Glut1和stomatin之間的相互作用。然而，在過(guò)表達(dá)stomatin的細(xì)胞中，stomatin與Glut1抗體明顯共沉淀。故猜測(cè)stomatin能夠在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中起到Glut1轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵作用。本研究在Glut1的第一個(gè)細(xì)胞外跨膜區(qū)插入flag標(biāo)簽，通過(guò)識(shí)別flag標(biāo)簽，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Glut1在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在stomatin過(guò)表達(dá)的A549、H520細(xì)胞中，Glut1在細(xì)胞膜中的表達(dá)量升高。而利用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)stomatin表達(dá)量降低時(shí)，Glut1的表達(dá)從細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)這些結(jié)果，猜測(cè)stomatin是通過(guò)影響Glut1表達(dá)位置的變化影響Glut1的功能。