應(yīng)用RT-PCR-RFLP鑒別2014年新余市麻疹病毒感染病例

文奇 ，廖秀海 ，潘虹 ，胡傳琛 ，龔甜 ，李健雄

(1.新余市疾病預(yù)防控制中心，江西 新余 338000；2.江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

麻疹是麻疹病毒引起的一種傳染性很強的急性呼吸道疾病，在疫苗可預(yù)防的病毒性傳染病中，麻疹的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)位居前列[1]。消除麻疹是全球共同致力于實現(xiàn)的目標[2]。中國大陸作為WHO西太區(qū)成員之一，自2006年開始實施消除麻疹行動計劃和方案，通過落實含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）接種、加強麻疹監(jiān)測和疫情調(diào)查處置等綜合消除措施，麻疹報告發(fā)病率自2009年逐年下降，而2012年之后卻有所回升[3-5]，麻疹消除工作面臨較大的挑戰(zhàn)。加強MCV適齡兒童的基礎(chǔ)免疫接種、開展特定人群的補充免疫活動（Supplementary Immunization Activity，SIA）仍是當前消除工作的首要任務(wù)。監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，少部分人在MCV接種后出現(xiàn)發(fā)熱、出疹癥狀，這些病例究竟是疫苗相關(guān)麻疹病例還是偶合感染麻疹野病毒[6-8]，需要認真對待并加以區(qū)分。本文引進周劍惠、龔甜等人創(chuàng)建的麻疹疫苗株與野毒株鑒別方法[9，10]，用以鑒別新余市2014年部分麻疹確診病例，現(xiàn)將有關(guān)分析情況進行報告。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2014年新余市轄區(qū)內(nèi)共采集47例麻疹疑似病例咽拭子標本，市疾控中心對這些標本進行麻疹、風疹病毒核酸檢測。選擇8例麻疹病毒核酸檢測陽性的病例標本作為研究對象，選擇北京天壇生物公司的麻疹風疹聯(lián)合減毒活疫苗（內(nèi)含S191麻疹疫苗株，批號：201501007）作為陽性對照，各選取1例2014年麻疹和風疹病毒核酸檢測均陰性、風疹核酸檢測陽性的病例標本作為陰性對照，編號分別為M1409、M1424。

1.2 麻疹病毒RNA提取 根據(jù)Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試劑盒 （Cat.No：74106，Lot No：145022097）說明書提取麻疹病毒RNA。

1.3 RT－PCR擴增麻疹病毒H基因 采用Qiagen公司 One Step RT－PCR Kit試劑盒(Cat：210212，Lot No：148047795)進行 RT－PCR 反應(yīng)。上游引物：5′－CTCAATCGAGCATCAGGTCA－3′，下游引物：5′－TACATTCCCTGGGACGTCAT－3′。 RT 反應(yīng)條件：60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30min，95℃ 15min。PCR 循環(huán)如下：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30 次循環(huán)，72℃ 10min，在 MJ Research PTC－200 儀器上進行擴增，擴增片段長度為438bp。

1.4 RFLP分析 每份RT－PCR產(chǎn)物均設(shè)立對照管和RFLP管，對照管為10μl的DNA產(chǎn)物，RFLP管為酶切產(chǎn)物，酶切反應(yīng)體系是：Takara公司AflII限制 性 酶 （Lot No：1236A）1μl， 緩 沖 液 2μl，DNA 10μl，37℃下酶切 1h。麻疹疫苗株 （A基因型）被AflII酶切成287bp和151bp 2個片段，而麻疹野病毒（非A基因型）不能被酶切。

1.5 電泳 One Step RT－PCR擴增產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠、北京六一產(chǎn)的DYY－6C型電泳儀電泳 1h，BIO－RAD公司 Universal HoodⅡ凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 2014年新余市麻疹、風疹陽性病例特征 2014年新余市共檢測47例麻疹疑似病例標本，檢出麻疹核酸陽性11例、風疹核酸陽性2例。這些陽性病例中，男、女比例為 1.17：1；MCV 接種史情況如下：0次的有3例 （均為＜8月齡的嬰兒），1次的有2例 （其中1例為首劑MCV接種第10d出疹的患兒，編號為M1415），2次的有1例，接種史不明的有7例（其中5例＞15歲）；＜8月的小月齡人群和＞15歲的大年齡人群的人數(shù)占總陽性病例數(shù)的61.5%（8/13）。

2.2 麻疹病毒H基因的RT－PCR－RFLP結(jié)果分析選取的新余市麻疹陽性標本 M1415、M1430、M1431、M1432、M1434、M1435、M1436、M1443 在AflII酶切前、后僅可見大小約438bp的RT－PCR產(chǎn)物 （未被酶切消化），2例陰性對照標本M1409、M1424均未出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，而陽性對照S191麻疹疫苗株的RT－PCR產(chǎn)物可被酶切成大小約為287bp、151bp的兩個片段（圖 1），表明 2014年新余市被分析的8例麻疹病例（包括MCV首劑接種第10d出疹的患兒）均為麻疹野病毒感染所致。

圖1 新余市2014年部分麻疹病毒H基因RT-PCR產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

目前我國兒童實行2劑次的MCV免疫程序，即8月齡接種第1劑（麻疹－風疹聯(lián)合疫苗），18月齡～24月齡接種第2劑 （麻疹－流腮－風疹聯(lián)合疫苗）[11]。MCV接種后若出現(xiàn)發(fā)熱、出疹癥狀，存在以下三種情形：一是由于疫苗中微量的雞胚細胞、小牛血清和抗生素等雜質(zhì)引起的過敏反應(yīng)，通常在接種后十幾小時或幾十小時內(nèi)產(chǎn)生一過性皮疹[12，13]，大約有 2%的受種者出現(xiàn)此類反應(yīng)[14，15]；二是人工感染，疫苗中的減毒活病毒在機體內(nèi)復(fù)制、產(chǎn)生免疫應(yīng)答而形成的疫苗相關(guān)病例[16]，一般發(fā)生在接種后1～2周內(nèi)[17]，多見于首次接種MCV的嬰兒[18]；三是偶合感染麻疹野病毒或其他發(fā)熱出疹性疾病，在接種疫苗時已處在發(fā)病的潛伏期[18]。在麻疹消除工作的關(guān)鍵時期，如何從病原學方面鑒別MCV受種者感染的麻疹病毒是疫苗株還是野生株，是個值得深究的課題。

基因序列分析無疑是最準確、可靠的方法，但在基層實驗室受條件所限，只能將標本外送測序，不僅費時費力，而且代價昂貴，難以大范圍推廣運用。周建惠等人受到Mori的啟發(fā)[19]，建立了利用RT－PCR－RFLP方法來鑒別中國麻疹病毒疫苗株與野生株的檢測技術(shù)。她們在研究中國麻疹病毒疫苗株與23種野生代表株的基因差異后，發(fā)現(xiàn)疫苗株H基因7666bp～7671bp上存在AflII酶切位點（CTTAAG），其長度為438bp的目的擴增片段可被AflII酶切成287bp、151bp的2個片段，23種野生株在相應(yīng)位置均無AflII酶切位點卻不被酶切消化，借此區(qū)分麻疹病毒疫苗株與野生株。相比于序列分析，RT－PCR－RFLP方法簡便、快速，更具經(jīng)濟實用性，非常適合基層實驗室使用。

在江西省疾控中心疾檢所工作人員的協(xié)助下，我們成功引進并驗證了上述麻疹病毒的RT－PCR－RFLP鑒別技術(shù)。疫苗株S191的擴增產(chǎn)物被AflII酶切成大小約為287bp、151bp的2個片段，2例麻疹陰性標本 （含1例風疹陽性標本）未被擴增，8例待分析的麻疹陽性病例標本成功得到擴增但不被AflII酶所消化，說明8例麻疹陽性病例均由麻疹野病毒所引起的，這與我省宜春市的報道相一致[20]；M1415患兒在MCV接種時已偶合感染麻疹野病毒，不屬于疫苗相關(guān)病例。另外通過對新余市2014年麻疹、風疹病例信息進行分析，我們發(fā)現(xiàn)這些陽性病例幾乎不體現(xiàn)出性別差異，年齡分布呈“雙向移位”趨勢，主要是＜8月的嬰兒和＞15歲的人群，原因是＜8月的嬰兒尚未接種疫苗，而＞15歲的人群常為無MCV接種史。