76株甲氧西林與紅霉素耐藥葡萄球菌的耐藥表型及基因型分析

梁有才，范菲楠，蔣利利，林思強(qiáng)，聶署萍，陸學(xué)東*（ .廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東湛江54000； .中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳580； .廣東醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東湛江54000）

葡萄球菌包括凝固酶陽性與凝固酶陰性葡萄球菌。凝固酶陽性葡萄球菌主要是金黃色葡萄球菌，凝固酶陰性葡萄球菌主要包括表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、頭葡萄球菌、人葡萄球菌、木糖葡萄球菌等。葡萄球菌是引起臨床感染的重要致病菌，甲氧西林是臨床治療產(chǎn)青霉素酶葡萄球菌感染的重要抗生素，耐甲氧西林葡萄球菌的出現(xiàn)，特別是對(duì)甲氧西林與大環(huán)內(nèi)脂類抗生素同時(shí)耐藥葡萄球菌的出現(xiàn)，給臨床治療帶來較大困難。本研究擬通過對(duì)中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院 2014－ 2016年分離所得的耐甲氧西林與紅霉素葡萄球菌的耐藥表型及耐藥基因型進(jìn)行分析，以及總結(jié)其臨床感染的科室分布與標(biāo)本來源情況，為臨床經(jīng)驗(yàn)治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，亦為進(jìn)一步建立相關(guān)菌株耐藥性的分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

76株葡萄球菌由中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院住院或門診患者各類體液標(biāo)本分離所得，經(jīng)過VITEKⅡCompact細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析，全部同時(shí)對(duì)苯唑西林與紅霉素耐藥，其中 54株為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)，另外 22株為甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌(methicillin resistance coagulase negative Staphylococcus，MRCNS)，包括 6 株 溶血葡萄球菌、 3株人葡萄球菌人亞種、 7株頭葡萄球菌、 1株木糖葡萄球菌、 5株表皮葡萄球菌。

1.2 儀器與試劑

EasyPure ?Bacteria Genomic DNA kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，PCR Master Mix(2×) (Fermentas公司)， M arker(北京全式金生物技術(shù)公司)，VITEK ⅡCompact 全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國梅里埃公司)， P TC-2000梯度 PCR循環(huán)儀(美國MJ Reasearch公司)。

1.3 臨床菌株的準(zhǔn)備及其耐藥表型的檢測(cè)

取患者體液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，挑取可疑菌落經(jīng) V ITEKⅡ Compact系統(tǒng)鑒定與藥敏檢測(cè)，篩選同時(shí)耐苯唑西林與紅霉素的葡萄球菌，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)菌株藥敏結(jié)果，同時(shí)挑取相應(yīng)菌落置負(fù) 80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?V ITEKⅡ Compact定期參加國家與省臨檢中心室間質(zhì)評(píng)與室內(nèi)質(zhì)控。

1.4 臨床菌株耐藥基因型的檢測(cè)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)葡萄球菌相應(yīng)耐藥基因序列，利用 P rimer 5.0軟件設(shè)計(jì)耐藥基因引物，同時(shí)設(shè)計(jì)細(xì)菌16srDNA引物，引物合成由上海輝睿生物科技有限公司完成。詳見表1。

表1 引物序列

(接上表)

1.4.2 耐藥基因的 PCR 擴(kuò)增分析 將待測(cè)菌株接種至血瓊脂平板，置 36.5 ℃ CO 2培 養(yǎng)箱培養(yǎng) 16～18 h，挑取數(shù)個(gè)單菌落至 1mL雙蒸水調(diào)成混懸菌液。采用核酸提取試劑盒(EasyPure ?Bacteria Genomic DNA kit)提取核酸模板液。

使用 PCR技術(shù)擴(kuò)增核酸模板靶基因。PCR反應(yīng)體系為： PCR Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L)0.1 μL， Reverse Primer(10 μmol/L)0.1 μL ，DNA模板液 2 .5 μL，補(bǔ)水使總體積達(dá) 25 μL。反應(yīng)程序第一步為 94 ℃5min；第二步為94 ℃ 1 min， 55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min， 40個(gè) 循環(huán)；第三步為72℃ 10min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)1 .5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

MRSA與MRCNS的耐藥及其所含耐藥基因的比較采用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、校正卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病區(qū)分布情況

MRSA檢出前三的科室為 ICU、神經(jīng)科、呼吸科，占比分別為： 37.0%(20/54)、 35.2%(19/54)、11.1%(5/54)，其余科室占比 16.7%(9/54)，包括腎內(nèi)科、脊柱骨科、心內(nèi)科各 2株以及甲乳外科、內(nèi)分泌科、消化科各 1株。MRCNS檢出最多科室為 ICU，占比45.5%(10/22)，其余科室合計(jì)占比 54.5%(12/22)，包括呼吸科、腫瘤科、康復(fù)科各 2株，以及神經(jīng)科、泌尿科、產(chǎn)科、新生兒、風(fēng)濕免疫科各1株。

2.2 標(biāo)本來源情況

MRSA絕大多數(shù)來源于痰，占 87.0%(47/54)；其余來源于尿、靜脈血、膿液、尿道分泌物，分別占5.6%(3/54)、3.7%(2/54)、1.9%(1/54)、1.9%(1/54)。MRCNS主要來源于患者無菌部位標(biāo)本，其中靜脈血占59.1%(13/22)、尿 18.2%(4/22)、腦脊液 9 .1%(2/22)、腹透液 4 .5%(1/22)、靜脈導(dǎo)管 4 .5%(1/22)，其余為痰，占 4 .5%(1/22)。從痰、靜脈血篩查出的MRSA或MRCNS數(shù)量差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 耐藥表型檢測(cè)結(jié)果

兩類菌株除了對(duì)紅霉素與苯唑西林同時(shí)耐藥外，MRSA對(duì) 6種抗菌藥物(氨芐青霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素)的耐藥率均在 50%以上，其中對(duì)氨芐青霉素與克林霉素的耐藥率達(dá) 100%；對(duì) 8種藥物(莫西沙星、利福平、復(fù)方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、萬古霉素、替加環(huán)素)的耐藥率均在 50%以下，其中對(duì) 5種藥物(利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、萬古霉素、替加環(huán)素)的耐藥率為0。MRCNS對(duì) 4種抗菌藥物(氨芐青霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星)的耐藥率均超過 50%，其中對(duì)氨芐青霉素的耐藥率亦為 100%；對(duì) 10種藥物(慶大霉素、四環(huán)素、莫西沙星、利福平、復(fù)方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、萬古霉素、替加環(huán)素)的耐藥率均在 50%以下，但僅對(duì)萬古霉素耐藥率為 0。詳見表 2。

2.4 耐藥基因型檢測(cè)結(jié)果

MRSA與MRCN均 篩出mecA基因，以及至少一種大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因(ermA、ermB、ermC、Sat4、msrA) 。MRSA排名前三的耐藥基因組合為mecA+ermA+ermC、mecA+ermB+Sat4、mecA+ermC，占比分別為 17%、 14%、 8 %，其余基因組合共占 6 1%。耐藥基因組合最多含有 5種基因，含 3種以上基因的組合占比為 8 1.5%(100.0% －3 .7%－ 14.8%)。MRCN排名前三的耐藥基因組合為：mecA+ermC、mecA+MsrA、mecA+ermA與mecA+ermC+MsrA，占比分別為： 22.7%、 22.7%、 13.6%、 13.6%；其余基因組合共占 27.4%；MRCNS耐藥基因組合最多含有 4種基因(mecA+ermC+Sat4+MsrA)，占比 4 .5%；含 3種以上基因的組合占比為 41.0%(100.0%－ 13.6% - 22.7%－22.7%)。見表3 。 各基因PCR 擴(kuò) 增的電泳條帶見圖1 。

表2 菌株耐藥表型檢測(cè)結(jié)果

3 討論

從臨床科室感染分布看，MRSA主要來源于ICU、 神經(jīng)科和呼吸科，而MRCNS在 ICU檢 出最多，占比高達(dá) 45.5%?？梢?， ICU是中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院該兩類細(xì)菌來源的重要科室。諸多文獻(xiàn)認(rèn)為，免疫力低下、侵入性醫(yī)療措施以及廣譜抗生素的使用是導(dǎo)致MRSA感染的高危因素，而 ICU患者恰好切合該因素[1-6]。由于在 ICU的檢出率較高，本研究提示導(dǎo)致MRCNS感染的高危因素與MRSA類似。

從標(biāo)本來源看，MRSA主 要來源于痰液，MRCNS主要來源于無菌標(biāo)本，靜脈血占比較大，兩者從痰與靜脈血的檢出率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 這主要是因?yàn)?，在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際工作中，從痰液分離出優(yōu)勢(shì)生長的MRSA考慮為致病菌而進(jìn)行鑒定藥敏；而凝固酶陰性葡萄球菌往往被認(rèn)為是人體黏膜定植菌，其導(dǎo)致肺部感染風(fēng)險(xiǎn)較低[2-5]。由痰標(biāo)本分離的MRCNS容易被考慮為非致病菌，從而忽略對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定藥敏或者醫(yī)療干預(yù)。本研究發(fā)現(xiàn)MRCNS從 ICU患者血液標(biāo)本篩查所得占比較高，可能是因?yàn)槌檠患褜?dǎo)致污染定值菌群所致，但若能排除污染因素，則提示MRCNS是由于缺少醫(yī)療干預(yù)措施導(dǎo)致其血源感染的可能性大，應(yīng)引起注意。

表3 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1 PCR擴(kuò)增靶基因電泳圖

從耐藥表型分析， 14種臨床常用抗生素中，兩類菌株除了對(duì)苯唑西林與紅霉素同時(shí)耐藥外(本研究中菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn))，MRSA與MRCNS對(duì)各種抗菌藥物的耐藥情況有所不同。一方面，MRSA耐藥率達(dá)50%以上的抗菌藥物較MRCNS多，耐藥率在 50%以下的抗菌藥物較MRCNS少，且 M RSA耐藥率達(dá)100%的抗菌藥物較MRCNS多；但另一方面，MRSA耐藥率為 0的抗菌藥物亦較MRCNS多。因此，實(shí)際上是否說明MRSA對(duì)臨床抗生素耐藥性比MRCNS更嚴(yán)重，尚待進(jìn)一步的研究。

從耐藥基因型分析，同一菌株MRSA與MRCNS均可同時(shí)篩出甲氧西林耐藥基因與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，說明兩類菌株的耐藥性均基于特定的耐藥機(jī)制。但MRSA能篩出比MRCNS更多耐藥基因，且篩出 3種以上基因組合的MRSA占比較MRCNS高，提示MRSA的耐藥機(jī)制比MRCNS更加復(fù)雜。

綜上所述，MRSA與MRCNS感染的高危因素類似，臨床應(yīng)注意對(duì)免疫力低下患者的接觸隔離以及相關(guān)抗生素的合理使用，特別是MRCNS的條件致病性可能是導(dǎo)致血源感染的重要途徑，應(yīng)高度重視。MRSA與MRCNS的抗生素耐藥情況大體一致但又有個(gè)別不同：兩類細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率均在 50%以上，對(duì)莫西沙星、利福平、復(fù)方新諾明、利奈唑胺、呋喃妥因、奎奴普丁/達(dá)福普汀、萬古霉素、替加環(huán)素耐藥率均在 50%以下；值得指出的是，MRSA對(duì)慶大霉素、四環(huán)素的耐藥率在 50%以上，MRCNS反之。MRSA與MRCNS均可篩出甲氧西林耐藥基因與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因，說明利用基因篩查能確認(rèn)相應(yīng)菌株對(duì)相關(guān)抗生素的耐藥性，該研究為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)為手段，建立快速鑒定菌株耐藥性的方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[7-8]。此外，同一菌株MRSA比MRCNS篩出更多的耐藥基因，篩出 3種以上耐藥基因占比更高，提示耐藥機(jī)制更為復(fù)雜，應(yīng)注意抗生素的合理使用。