粵東地區(qū)1430例新生兒遺傳性耳聾基因篩查結(jié)果分析

方炳雄，蔡勉珊，張俊賢，翁文婕，馮心樂，阮 杰，黃 娟* （廣東省普寧市人民醫(yī)院 .檢驗(yàn)科， .兒科，廣東普寧5500； .廣東凱普生物科技有限公司，廣東潮州50； .廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣東東莞5808）

耳聾是臨床上最常見的感覺性疾病，與遺傳和多種環(huán)境因素(如醫(yī)療因素、環(huán)境暴露、創(chuàng)傷、藥物等)有關(guān)。資料顯示，全球范圍內(nèi)約 60%的耳聾患者與遺傳因素有關(guān)[1-2]。在中國(guó)，每年先天性耳聾患兒出生率約為 0 .15%[3]，嚴(yán)重影響出生人口素質(zhì)。因此新生兒聽力篩查，已經(jīng)作為一種快速診斷和干預(yù)的手段。我國(guó)的研究表明， 80%的遺傳性耳聾是由GJB2、SLC26A4、線粒體 DNA、GJB3功能基因突變引起的[4]。本研究采用 PCR結(jié)合導(dǎo)流雜交技術(shù)對(duì)粵東地區(qū)出生新生兒的這 4種耳聾易感基因 13個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在了解本地區(qū)新生兒遺傳性耳聾基因的突變情況，為預(yù)防與阻斷耳聾患兒的發(fā)生提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取 2017年1月－2018年9月粵東地區(qū)出生的新生兒為研究對(duì)象，在家屬知情同意情況下，自愿接受耳聾基因檢測(cè)。入選對(duì)象中，揭陽市 695例，潮州市 609例，汕頭市126例，共計(jì)檢查1430例新生兒。

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組 DNA提取試劑盒、耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒與醫(yī)用核酸分子雜交儀和 PCR擴(kuò)增儀均由廣東凱普生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1DNA的提取 用含 E DTA-K3的真空采血管，采集新生兒靜脈血 2.0～3.0 mL，或采用足跟采血，制作血斑卡。采用血液基因組 DNA提取試劑盒(離心柱型)，提取純化 DNA。用紫外分光光度法檢測(cè) DNA質(zhì)量濃度和純度，確保 DNA質(zhì)量濃度≥ 200 ng/L，純度為 A 260/A280的比值在 1 .8～2.0，置于－ 20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 耳聾基因檢測(cè) 按照耳聾基因檢測(cè)試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)的操作說明書，測(cè)定 4個(gè)我國(guó)常見的耳聾易感基因的 13個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，包括GJB2(35delG、176del16、 235delC、 299delAT、155del TCTG)、SLC26A4(IVS7-2A>G、 2168A>G、 1229C>T)、線粒體 DNA(1494C>T、 1555A>G、7 445A>G、12201T>C)、GJB3(538C>T)點(diǎn)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：先預(yù)變性：95℃，9 min；再 95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 共 40 循 環(huán)；最后 72 ℃ 5 min，16 ℃10 s 完成擴(kuò)增。 PCR 產(chǎn) 物熱變性成為單鏈 DNA， 與低密度基因芯片探針雜交，通過顯色反應(yīng)，得到清晰可見的檢查結(jié)果。

1.3.3 廣東地區(qū)耳聾基因篩查概況 查閱2017 年 1 月至 2018年 9月廣東地區(qū)發(fā)表的耳聾基因篩查相關(guān)文獻(xiàn)，分析廣東地區(qū)耳聾基因篩查概況。

2 結(jié)果

2.1 基因篩查結(jié)果

1430例新生兒中，檢出耳聾基因突變的 55例，總陽性率為 3 .85%，其中 GJB2、 S LC26A4、 GJB3和線粒體 DNA耳聾基因的突變率依次為 1 .61%、1.33%、0 .42%和0 .28%。檢出最多是GJB2235del 和SLC26A4 IVS7-2A>G位點(diǎn)的突變，單基因檢出率分別為1.40%和1 .05%雙基因突變檢出 3例，其中GJB2235delC/SLC26A4 IVS7-2 復(fù)合雜合突變2例，GJB2176del16/SLC26A4 IVS7-2復(fù)合雜合突變1例。各基因突變位點(diǎn)篩查結(jié)果見表1。

2.2 廣東地區(qū)耳聾基因篩查概況

查閱 2017年1月至 2018年9月廣東地區(qū)發(fā)表的耳聾基因篩查相關(guān)文獻(xiàn)，共篩選出 8篇具有代表性的論文[5-13]，結(jié)果如表 2所示， 4個(gè)基因的總突變率為3.31%～4.47%，主要的突變位點(diǎn)是 GJB2235delC 和SLC26A4 IVS7-2A>G，其次是 GJB2299delAT 和線粒體 DNA1555A>G。

表1 1430例新生兒耳聾基因篩查結(jié)果和突變攜帶率

(續(xù)上表)

表2 廣東地區(qū)耳聾基因篩查概況

3 討論

先天性耳聾是一種常見的出生缺陷疾病，嚴(yán)重影響出生人口素質(zhì)與家庭幸福。我國(guó)每年新增先天性聽力障礙約 3 .5萬例[14]。近年來，隨著優(yōu)生優(yōu)育的思想越來越受到重視，國(guó)內(nèi)學(xué)者關(guān)注遺傳性耳聾疾病，提倡孕前普查、產(chǎn)前篩查和新生兒篩查三級(jí)防控。中國(guó)人遺傳性耳聾主要由 GJB2、 S LC26A4、GJB3 及 線粒體 DNA基因發(fā)生突變所致，且這 4個(gè)基因均存在高發(fā)熱點(diǎn)[15]。廣東省耳聾基因篩查走在國(guó)內(nèi)前沿，已有廣州[10]、佛山市[9,16]、中山市[11-12]和東莞市[7]等城市對(duì)各自地區(qū)的耳聾分布情況的進(jìn)行報(bào)道，尚未見粵東地區(qū)報(bào)道有關(guān)耳聾基因篩查的論文。本研究結(jié)果顯示，粵東地區(qū) 4個(gè)耳聾基因總體突變率為 3 .85%，高于廣州[10]、東莞[7]和佛山[9]等地區(qū)，低于深圳[5-6]和珠海[8]等地區(qū)。 4個(gè)耳聾基因GJB2、SLC26A4、 GJB3 和 線粒體 DNA的突變率依次為 1 .61%、 1 .33%、 0 .42%和 0 .28%，與廣東其他地區(qū)4 個(gè)基因的檢出突變類型相似。

所檢測(cè)的 13 個(gè) 突變位點(diǎn)中，未檢出 35delG、155delTCTG、 1494C>T、 7445A>G和 12201T>C位點(diǎn)，可能與我們的標(biāo)本量少有關(guān)。檢出最多是GJB2235del和SLC26A4 IVS7-2A>G位點(diǎn)的突變，單基因檢出率分別為 1 .40%和 1 .05%，與廣東其他地區(qū)主要的突變類型一致。 GJB2基因突變是中國(guó)遺傳性耳聾的最重要遺傳因素，與重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾有關(guān)，該基因突變位點(diǎn)及其發(fā)生頻率在不同種族和不同地區(qū)具有差異性，其中 235delC是亞洲人群最常見的突變[17]。 GJB2176del16與GJB2299delAT位點(diǎn)的突變?cè)诒镜貐^(qū)也有檢出。 SLC26A4最常見的突變類型為 I V S7-2A>G[18]，該基因的突變表現(xiàn)為遲發(fā)型非綜合征性耳聾，患兒出生時(shí)多為聽力正常，后因劇烈碰撞、噪音或感冒因素，出現(xiàn)聽力明顯下降，有“一巴掌致聾”的特點(diǎn)。本研究檢出GJB2235delC 和 SLC26A4 IVS7-2 復(fù)合雜合突變 2例，GJB2176del16 和 SLC26A4 IVS7-2 復(fù) 合雜合突變1例，這種雙基因發(fā)生突變，提示遺傳性耳聾的機(jī)制復(fù)雜性。本研究檢出 6例 GJB3538C>T雜合突變。該基因是1998年中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院夏家輝院士克隆的我國(guó)本土首個(gè)耳聾基因[19]。 GJB3基因突變攜帶者多為青少年時(shí)期聽力正常，發(fā)育到青壯年時(shí)期(20～ 30歲)聽力逐漸下降，可發(fā)展不同程度的耳聾患者，主要癥狀為后天高頻感音神經(jīng)性耳聾[20]。在線粒體 DNA耳聾基因的篩查中，檢出 1555A>G位點(diǎn)的3例均質(zhì)突變和1例雜合突變。該基因?qū)儆谀赶颠z傳，表現(xiàn)為遲發(fā)型或藥物性致聾，多與氨基糖苷類抗生素誘發(fā)耳聾有密切關(guān)系[21]。該類型的突變需關(guān)注患者和家庭成員的抗生素使用，特別是攜帶 1555A>G均質(zhì)突變的女性寶寶。

耳聾基因篩查是早期發(fā)現(xiàn)新生兒聽力障礙的重要輔助檢測(cè)方法。進(jìn)行基因檢測(cè)不僅可以明確病因，還可以有針對(duì)性地對(duì)高危人群做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)，盡量減少耳聾的發(fā)生，對(duì)藥物敏感性耳聾基因攜帶者進(jìn)行用藥指導(dǎo)，對(duì)生育進(jìn)行遺傳優(yōu)生指導(dǎo)，避免生育遺傳性耳聾患兒。