轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)胰腺癌腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的研究

史壹雄 梁雅琴 葉百亮 胡炳仁 阮小蛟

胰腺癌細(xì)胞具有極強(qiáng)的運(yùn)動侵襲能力，早期即可出現(xiàn)胰周組織侵襲浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致根治性手術(shù)切除率極低和術(shù)后短期內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，造成患者死亡[1,2]。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤組織中具有永久自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，所占比例極少，但因具有永久自我更新能力，故是腫瘤源源不斷產(chǎn)生的根源[3,4]。白細(xì)胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)133是最常用的干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD133陽性細(xì)胞具有自我更新和無限增殖、致瘤性強(qiáng)等特點，而CD133陰性的細(xì)胞缺乏這種潛力[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，CD133與腫瘤惡性程度和侵襲性相關(guān)，并且其表達(dá)程度與胰腺癌患者的存活率降低相關(guān)[6]。通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，能為腫瘤細(xì)胞提供運(yùn)動遷徙和向鄰近組織侵襲的能力[7,8]，EMT典型表現(xiàn)為鈣黏蛋白E(E-cadherin)丟失。研究表明胰腺癌患者體內(nèi)TGF-β1呈現(xiàn)過度表達(dá)狀態(tài)，高血清轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[9]。TGF-β1是EMT的重要誘導(dǎo)因子，EMT在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動侵襲能力的同時，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞獲得CSC特性[10,11]。 本研究通過將TGF-β作用于PANC-1、BxPC-3、AsPC-1 3種胰腺癌細(xì)胞系，研究TGF-β對胰腺癌細(xì)胞生長的影響及CD133表達(dá)的影響，并檢測胰腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)因子，E-cadherin和波形蛋白(vimentin)的表達(dá)，探討TGF-β在胰腺癌的發(fā)展過程中的所起作用，為從干細(xì)胞的層面上抑制胰腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移提供新的思路。

材料與方法

1.細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng):本研究采用3種人類胰腺癌細(xì)胞系：PANC-1、BxPC-3和AsPC-1細(xì)胞株作為體外模型，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。PANC-1細(xì)胞和BxPC-3細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Media培養(yǎng)基, 500ml C11995, 美國Gibco公司)中進(jìn)行，AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的 R PMI-1640培養(yǎng)基(RPMI MEDIUM 1640,500ml,C11875, 美國Gibco公司)中進(jìn)行。以上3種細(xì)胞均培養(yǎng)于CO2含量5%，37℃及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。TGF-β1(美國R&D systems公司)儲存于添加了0.1%的胎牛血清的4mmol/L晶體鹽酸溶液中凍存于-20℃冰箱，在每次實驗前融化并溶解在各細(xì)胞相應(yīng)的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中。

2.細(xì)胞計數(shù)法：取3種人類胰腺癌細(xì)胞系對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，對照組培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的普通培養(yǎng)基，實驗組培養(yǎng)基為含10ng/ml TGF-β1的10%胎牛血清培養(yǎng)基，各2ml，第1～6孔細(xì)胞分別培養(yǎng)1、2、3、5、6天，每3天更換培養(yǎng)液，第1天取第1孔細(xì)胞分別取實驗組及對照組用細(xì)胞計數(shù)器行癌細(xì)胞計數(shù)，第2天取第2孔細(xì)胞行癌細(xì)胞計數(shù)，依次類推。上述實驗重復(fù)3次。使用Excel繪制生長曲線，并作圖法在細(xì)胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細(xì)胞增加一倍所需的時間即細(xì)胞倍增時間，即在Excel內(nèi)添加生長曲線的趨近線，并同時顯示公式y(tǒng)=k×ex，k為一常數(shù)系數(shù)，在細(xì)胞指數(shù)生長期內(nèi)分別取兩個呈倍增關(guān)系的y值，根據(jù)公式y(tǒng)=k×ex計算相應(yīng)x值，兩x值相減即為細(xì)胞倍增時間。

3.流式細(xì)胞學(xué):每種胰腺癌細(xì)胞系處理時分3組，即空白組、對照組、實驗組，每種胰腺癌細(xì)胞以5×105個/ml的濃度種植于6孔板內(nèi)，每孔包含10%胎牛血清的培養(yǎng)基2ml，實驗組孵育過夜后換用TGF-β1濃度為10ng/ml的10%胎牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)基2ml，空白組與對照組則加不包含TGF-β1的普通10%胎牛血清的培養(yǎng)基2ml。作用72h后獲得對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，胰酶(0.25%Trypsin-EDTA, 1X, 100ml, 美國Gibco公司)消化獲得單細(xì)胞懸液，對照組與實驗組均在避光條件下在細(xì)胞液內(nèi)加樣反應(yīng)。避光條件下在細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加樣反應(yīng)：依次加入80μl PBSE(pH值為7.2的PBS，含0.5%BSA,2mmol/L的EDTA液即10ml PBS液中加入0.05g BSA 和 7.45mg EDTA)，再加入20μl FCR blocker試劑(德國Miltenyi Biotec公司)及10μl CD133/1 (AC133)-PE, human(德國Miltenyi Biotec公司,貨號：130-080-801)，室溫避光孵育20min后再次用PBSE漂洗2次，振蕩混勻后于1h內(nèi)使用Beckman Coulter FC500 流式細(xì)胞儀，使用CXP流式細(xì)胞學(xué)軟件 (美國Beckman Coulter公司) 上機(jī)檢測CD133+的表達(dá)率, 空白組不經(jīng)過上述加樣過程直接使用 CXP 流式細(xì)胞學(xué)軟件上機(jī)檢測CD133+的表達(dá)率。

4.PANC-1及TGF-β1表達(dá)Western blot法檢測：蛋白樣品制備：組織勻漿，裂解，臺式離心機(jī)，11000r/min，4℃離心10min。BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，化學(xué)發(fā)光顯影。actin作為參照基因。 E-cadherin (cell signaling，#3195)，一抗?jié)舛?∶1000，二抗?jié)舛?anti rabbit)1∶3000，135000；Vimentin (美國R&D system公司，AF2105 )，一抗?jié)舛?∶1000，二抗?jié)舛?anti goat)1∶3000，55000。

結(jié) 果

1.TGF-β1對3種胰腺癌細(xì)胞生長的影響:TGF-β1處理PANC-1實驗組細(xì)胞及無處理對照組6天培養(yǎng)結(jié)果顯示兩組細(xì)胞均呈對數(shù)生長，培養(yǎng)前3天，兩組生長速度相似，兩組細(xì)胞計數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，培養(yǎng)第5天及第6天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細(xì)胞生長明顯受抑制，其細(xì)胞計數(shù)顯著低于對照組(P均<0.05)，PANC-1對照組、實驗組培養(yǎng)5天的PANC-1胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(13.70±1.03)×105個、(9.97±0.95)×105個；兩組培養(yǎng)6天的PANC-1胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(24.10±2.64)×105個、(15.41±1.35)×105個，詳見圖1。計算對照組和實驗組細(xì)胞群體倍增時間分別為29.0和35.2h，倍增時間明顯延長。

圖1 TGF-β1對PANC-1細(xì)胞生長的影響

TGF-β1處理BxPC-3實驗組細(xì)胞及無處理對照組6天培養(yǎng)結(jié)果顯示兩組細(xì)胞亦呈指數(shù)生長，培養(yǎng)前2天，兩組生長速度相似，兩組細(xì)胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，培養(yǎng)第3天及第5天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細(xì)胞生長明顯受抑制，其細(xì)胞計數(shù)顯著低于對照組(P均<0.05)，第6天實驗組細(xì)胞計數(shù)較對照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。BxPC-3對照組、實驗組培養(yǎng)3天的BxPC-3胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(5.24±0.31)×105個、(4.85±0.33)×105個；兩組培養(yǎng)5天的BxPC-3胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(12.97±0.64)×105個、(8.78±0.36)×105個；兩組培養(yǎng)6天的BxPC-3胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(20.71±2.51)×105個、(14.36±3.55)×105個，詳見圖2。計算對照組和實驗組細(xì)胞群體倍增時間分別為34.8和41.2h，倍增時間明顯延長。

圖2 TGF-β1對BxPC-3細(xì)胞生長的影響

TGF-β1處理AsPC-1實驗組細(xì)胞及無處理對照組6天培養(yǎng)結(jié)果顯示兩組細(xì)胞均呈對數(shù)生長，培養(yǎng)前2天，兩組生長速度相似，兩組細(xì)胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，培養(yǎng)第3天、第5天及第6天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細(xì)胞生長明顯受抑制，其細(xì)胞計數(shù)顯著低于對照組(P均<0.05)，AsPC-1對照組和實驗組培養(yǎng)3天的AsPC-1胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(4.75±0.35)×105個、(3.83±0.06)×105個；兩組培養(yǎng)5天的AsPC-1胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(12.67±0.81)×105個、(10.93±1.37)×105個；兩組培養(yǎng)6天的AsPC-1胰腺癌細(xì)胞數(shù)分別為(18.72±1.21)×105個、(14.53±2.34)×105個，詳見圖3。對照組和實驗組細(xì)胞群體倍增時間分別為30.8和34.49h,倍增時間延長。

圖3 TGF-β1對AsPC-3細(xì)胞生長的影響

2.3種胰腺癌細(xì)胞系CD133+胰腺癌細(xì)胞比例：TGF-β1作用于人類胰腺癌PANC-1、BxPC-3及AsPC-1細(xì)胞系72h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞比例變化情況，結(jié)果顯示PANC-1胰腺癌細(xì)胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細(xì)胞率分別為(23.57±5.46)×104、(28.78±14.38)×104及(105.90±27.82)×104，BxPC-3胰腺癌細(xì)胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細(xì)胞率分別為(47.73±5.86)×104、(51.60±7.75)×104及(124.73±52.84)×104，AsPC-1胰腺癌細(xì)胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細(xì)胞率分別為(39.20±4.81)×104、(39.96±5.13)×104及(88.80±15.94)×104，詳見圖4、圖5。

圖4 3種胰腺癌細(xì)胞空白組、對照組及實驗組流式細(xì)胞學(xué)檢測CD133+細(xì)胞率

獨立樣本t檢驗顯示，PANC-1、BxPC-3及AsPC-1 3種胰腺癌細(xì)胞系空白組與對照組CD133+細(xì)胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，3種胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞系實驗組與對照組比較，CD133+細(xì)胞比例實驗組較對照組明顯升高(P<0.05，圖5)。

圖5 3種胰腺癌細(xì)胞不同處理組CD133+細(xì)胞比例(1/萬)

3.Western blot法檢測結(jié)果：(1)PANC-1胰腺癌細(xì)胞系E-cadherin表達(dá)：Western blot法檢測結(jié)果顯示，10ng/ml TGF-β1處理組PANC-1胰腺癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)較正常組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6)。(2)PANC-1胰腺癌細(xì)胞系Vimentin表達(dá)：Western blot法檢測結(jié)果顯示， 10ng/ml TGF-β1處理組PANC-1胰腺癌細(xì)胞Vimentin表達(dá)較對照組有有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,圖7)。

圖6 E-cadherin Western blot法檢測結(jié)果

圖7 Vimentin Western blot法檢測結(jié)果

討 論

在腫瘤形成過程中，TGF-β1可能以自分泌或旁分泌的方式而對腫瘤的進(jìn)展起雙相調(diào)節(jié)作用。早期腫瘤形成過程中，TGF-β1起抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，進(jìn)而抑制腫瘤生長。 相反，癌細(xì)胞后來通過增加TGF-β1拮抗劑的表達(dá)、突變TGF-β1受體或使SMAD4失活逐漸對 TGF-β1-介導(dǎo)的生長抑制作用產(chǎn)生了適應(yīng)和抵抗，最終，TGF-β1對腫瘤的生長抑制作用消失，并進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)橥ㄟ^提升EMT或誘導(dǎo)血管生成而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12,13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞在TGF-β1作用后生長速度減緩，倍增時間延長，TGF-β1在生長的中后期均能顯著抑制3種腫瘤細(xì)胞的生長速率，但起效及作用持續(xù)時間不同。

TGF-β1作用后能顯著提高胰腺癌BxPC-3及AsPC-1細(xì)胞系中CD133+細(xì)胞比例(P<0.05)。而CD133+陽性細(xì)胞代表胰腺癌CSC,CD133+胰腺CSC已被證明是具有完全的致瘤性，以及對放化療高度抵抗，且CD133陽性的胰腺癌CSC對腫瘤的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[14～16]。

流式細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果提示10ng/ml的TGF-β1作用后3種胰腺癌細(xì)胞系的CD133+表達(dá)增加了。這里似乎有矛盾之處，TGF-β1抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長，但卻提高了CSC的比例，可能有兩種原因造成以上結(jié)果：(1)TGF-β1抑制了非致腫瘤細(xì)胞的生長，但對CSC的作用甚微，故導(dǎo)致CSC相對增多，其比例增高。(2)10ng/ml的TGF-β1雖抑制了普通非致腫瘤細(xì)胞的生長，但誘導(dǎo)CSC干細(xì)胞形成，TGF-β1作為腫瘤EMT的誘導(dǎo)劑，腫瘤細(xì)胞的EMT和CSC之間存在著“相輔相成”的有機(jī)聯(lián)系，腫瘤細(xì)胞可通過EMT而獲得CSC的特性，從而獲得高致瘤能力。You等[17]研究采用EMT的誘導(dǎo)因子TGF-β作用于CD133-的肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)產(chǎn)生CD133+的肝癌細(xì)胞，且體內(nèi)荷瘤實驗證明誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD133+肝癌細(xì)胞與野生型CD133+肝癌細(xì)胞的致瘤能力未見明顯差異，具有肝癌CSC特性。

腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動侵襲能力和CSC特性對于實現(xiàn)腫瘤進(jìn)展同等重要，兩者缺一不可。上皮屏障功能和完整性依賴于細(xì)胞間連接的形成。鈣黏蛋白(E-cadherin)構(gòu)成的主要跨膜組件和黏合連接處并且對上皮和信息交互至關(guān)重要。鈣黏蛋白丟失常被病理學(xué)家使用作為腫瘤細(xì)胞入侵的一個標(biāo)志。用轉(zhuǎn)基因動物實驗證明鈣黏蛋白的過表達(dá)可預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)PANC-1胰腺癌細(xì)胞系E-cadherin有降低趨勢，且Vimentin有增高趨勢，但均無顯著性差異，考慮細(xì)胞培養(yǎng)時間尚短，相當(dāng)于胰腺癌細(xì)胞發(fā)展早期，故TGF-β1誘導(dǎo)EMT作用不顯著有關(guān)。研究顯示，采用不同劑量(5、10、20、50ng/ml)的TGF-β1作用BxPC-3胰腺癌細(xì)胞均24h，各劑量E-cadherin的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而采用不同時間(0、4、7、14天)的TGF-β1，劑量均為10ng/ml 作用BxPC-3胰腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示E-cadherin的表達(dá)隨著作用時間的延長而降低，從4～7天開始有差異[18]。研究證實，Erk途徑的激活參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT過程[19]。TGF-β1雖然對BxPC-3、 AsPC-1及PANC-1 3種胰腺癌細(xì)胞系均有抑制其細(xì)胞生長作用，但TGF-β1作用增加CSC比例，故提示非選擇性應(yīng)用TGF-β1可能并不利于胰腺癌細(xì)胞的生長，卻能提高CD133+的比例，增加胰腺癌細(xì)胞的侵襲性及致瘤性，TGF-β1在不同時期對胰腺癌細(xì)胞的作用及其具體機(jī)制將成為未來的研究重點。