原位缺口末端標(biāo)記法觀察加味青蒿鱉甲湯干預(yù)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞凋亡的研究

藺禹帆，粟 栗

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

肺癌，即原發(fā)性支氣管癌，為起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤[1]。有調(diào)查顯示，不論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在發(fā)展中國(guó)家，肺癌的發(fā)病率均為惡性腫瘤發(fā)病率之首；并預(yù)測(cè)到2020年，在發(fā)展中國(guó)家中，肺癌的發(fā)病率仍排名第一位[2]。我國(guó)第三次死亡原因調(diào)查結(jié)果顯示，肺癌已成為我國(guó)癌癥死亡原因的首位，與上世紀(jì)70年代比較上升了465%[3]。雖然肺癌的治療技術(shù)日新月異，但5年生存率從4%僅上升至12%左右，現(xiàn)有的抗腫瘤藥物仍只能起到緩解病情作用，患者無(wú)進(jìn)展生存期平均僅延長(zhǎng)3個(gè)月～5個(gè)月。因此，對(duì)于肺癌的治療是醫(yī)學(xué)界共同面臨的難題。

青蒿鱉甲湯出自清代溫病學(xué)家吳鞠通所著的《溫病條辨》。根據(jù)臨床肺癌常見(jiàn)辨證分型進(jìn)行加減化裁，組成加味青蒿鱉甲湯，在臨床應(yīng)用中對(duì)于提高機(jī)體內(nèi)在抗病能力來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)、減少放化療所帶來(lái)的不良反應(yīng)、控制癌性發(fā)熱等方面具有良好的療效。

本實(shí)驗(yàn)采用原位末端標(biāo)記法，研究加味青蒿鱉甲湯對(duì)Lewis肺癌小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，通過(guò)對(duì)凋亡指數(shù)的分析，探討加味青蒿鱉甲湯干預(yù)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 Lewis 細(xì)胞株（Lewis Lung carcinoma，LLC），于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康C57BL/6小鼠（18 g±2 g）70只，SPF級(jí)，6周齡，雄性，于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料喂養(yǎng)，自由飲食及飲水。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)光線充足，溫度與濕度適宜。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.3 受試藥物 加味青蒿鱉甲湯由青蒿、鱉甲、生地、知母、丹皮、黃芪、地龍、姜半夏、白花蛇舌草共9味中藥組成（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）；順鉑注射液：6 mL：30 mg（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司）。

1.4 試劑 1 640培養(yǎng)基（武漢Boster生物工程有限公司）；胎牛血清（美國(guó)gibco公司）；胰蛋白酶（武漢Boster生物工程有限公司）；二甲基亞砜（Biosharp生物科技）；青霉素和鏈霉素（山東魯抗）；TUNEL試劑盒（上海生工）；DAB顯色試劑盒（邁新試劑）；4%水合氯醛，福爾馬林，各個(gè)濃度乙醇，二甲苯等。

1.5 儀器 150i CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermofisher公司）；超凈臺(tái)（美國(guó)Thermofisher公司）；DMI3000 倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；烘箱（美國(guó)Thermofisher公司）；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY公司）；石蠟切片機(jī)，組織自動(dòng)包埋機(jī)等。其他：培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管、血清瓶、微孔過(guò)濾膜、石蠟?zāi)ぁ⒑銣厮∠?、離心機(jī)、醫(yī)用直尖眼科剪、醫(yī)用彎尖眼科剪、醫(yī)用止血鉗、直頭鑷子、彎頭鑷子，醫(yī)用紗布、醫(yī)用棉球、灌胃器、注射器、微量移液器、EP管若干等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 應(yīng)用1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素+鏈霉素）配制全培養(yǎng)基，于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞。用倒置顯微鏡觀察Lewis肺癌細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形或橢圓形并有部分細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞貼壁數(shù)量達(dá)培養(yǎng)瓶底壁的80%左右時(shí)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可傳代、凍存。整個(gè)過(guò)程一定要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。

2.2 荷瘤小鼠模型的制備 將細(xì)胞濃度調(diào)整到約4×107個(gè)/mL，用1 mL注射器每次抽取0.05 mL細(xì)胞懸液，接種于C57BL/6小鼠右腋后線處皮下。在接種過(guò)程中應(yīng)不斷吹打細(xì)胞懸液，防止細(xì)胞沉降而造成接種細(xì)胞濃度不均，并盡量縮短造模時(shí)間。造模后，每天檢查小鼠接種部位。到造模第8天時(shí)，在小鼠接種部位可觸及米粒大小腫塊，表示造模成功。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 選取造模成功 的小鼠，測(cè)量每只小鼠腫瘤的長(zhǎng)軸（a）與短軸（b），按照v=ab2/2計(jì)算出每只小鼠腫瘤的體積。按照腫瘤體積的大小，將小鼠隨機(jī)分為模型組，加味青蒿鱉甲湯低劑量組、加味青蒿鱉甲湯中劑量組、加味青蒿鱉甲湯高劑量組、順鉑組，每組10只。造模第8天開(kāi)始，模型組給予生理鹽水0.4 mL灌胃，1 d/次；加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組分別按照1:2:4的比例給予中藥湯劑0.4 mL灌胃，1 d/次；順鉑組給予濃度為0.15 mg/mL的順鉑注射液0.2 mL腹腔注射，隔日1次。

2.4 取材 給藥第15天取材。取材前稱小鼠的體質(zhì)量，按照0.1 mL/10 g的標(biāo)準(zhǔn)用4%的水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血后，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤。將腫瘤組織應(yīng)用福爾馬林固定。

2.5 TUNEL法檢測(cè) 將用福爾馬林固定好的腫瘤組織，修整為大小約為0.3 mm×1.0 cm×1.0 cm的組織塊，放入脫水盒中，用自來(lái)水沖洗去福爾馬林固定液。常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚3 μm。采用TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（POD），按說(shuō)明書(shū)操作。光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞染色情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 19.0，采用單因素方差分析分析處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL），對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。細(xì)胞核呈藍(lán)色者為蘇木精復(fù)染的陰性細(xì)胞，即腫瘤細(xì)胞。模型組內(nèi)僅見(jiàn)個(gè)別凋亡細(xì)胞；低劑量組有少量的凋亡細(xì)胞；中劑量組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞；高劑量，順鉑組可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞。（見(jiàn)圖1）

圖1 加味青蒿鱉甲湯對(duì)Lewis肺癌小鼠細(xì)胞凋亡的影響

每張切片選取5個(gè)高倍鏡（10×40）視野，按照“每張切片至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示（%）計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。與模型組相比較，各用藥組的凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.01），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。順鉑組的凋亡指數(shù)高于中藥各組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 加味青蒿鱉甲湯對(duì)細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（±s）

表1 加味青蒿鱉甲湯對(duì)細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響（±s）

注：與模型組比較，# P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 數(shù)量/只 細(xì)胞凋亡指數(shù)/%模型組 8 7.59±2.04中藥低劑量組 9 26.68±2.96#△△中藥中劑量組 9 31.38±4.72#△△中藥高劑量組 9 38.71±3.81#△順鉑組 7 51.07±5.67#

4 討論

對(duì)于多細(xì)胞生物而言，為了維持機(jī)體的正常代謝過(guò)程和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，會(huì)有大量“多余的”或“生病的”細(xì)胞以死亡的方式被處理掉，1972年，病理學(xué)家Kerr等人將自然細(xì)胞死亡過(guò)程定義為凋亡[5]34。細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化的過(guò)程，這一程序早已預(yù)設(shè)于活細(xì)胞之中，當(dāng)細(xì)胞受到來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外的凋亡誘導(dǎo)因素作用的時(shí)候，這一程序啟動(dòng)，并由嚴(yán)格和復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控而發(fā)生自主性細(xì)胞有序死亡過(guò)程[5]，34.50%以上的腫瘤細(xì)胞在凋亡機(jī)制上存在缺陷，凋亡異常直接導(dǎo)致本該死亡的細(xì)胞被保留下來(lái)，其中有些突變的細(xì)胞增殖失控，從而形成腫瘤[6]。

細(xì)胞凋亡過(guò)程中有一系列特征性的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)的改變，其中，最重要和最具特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內(nèi)切酶的激活導(dǎo)致染色質(zhì)DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180～200 bp為最小單位的單體或寡聚體片段[7]177。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，于1992年由Gavricli等首先報(bào)道[7]188。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的TUNEL法，采用蛋白酶K消化法對(duì)標(biāo)本細(xì)胞打孔，后將標(biāo)本與末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）和過(guò)氧化酶標(biāo)記的脫氧核苷酸（dUTP）一起溫育，在溫育過(guò)程中，TdT將標(biāo)記的dUTP連接到DNA片段的自由3’-末端上，DAB顯色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察[7]179。

在臨床應(yīng)用中，青蒿鱉甲湯加味主要針對(duì)癌性發(fā)熱、放化療后體虛以及癌轉(zhuǎn)移等癥狀。目前認(rèn)為癌性發(fā)熱主要與腫瘤壞死組織的吸收、腫瘤的某些代謝產(chǎn)物致熱原、腫瘤組織釋放前列腺素 E、器官代謝失常及腫瘤組織自身存在炎癥有關(guān)[8]。臨床上治療癌性發(fā)熱多以物理降溫或使用非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥治療為主，故而中醫(yī)治療具有一定的優(yōu)勢(shì)。周軍等[9]運(yùn)用青蒿鱉甲湯加減治療癌性發(fā)熱54例，其中顯效30例、有效16例、無(wú)效8例，有效率為85%。司瑞超[10]、董方[11]、任惠芳等[12]臨床醫(yī)生應(yīng)用青蒿鱉甲湯加減治療癌性發(fā)熱，并與吲哚美辛栓、消炎痛栓、痰熱清、塞來(lái)昔布等臨床常用藥比較后，認(rèn)為青蒿鱉甲湯加減治療癌性發(fā)熱具有良好的療效。另外，臧凱[13]、王蓉等[14]、李麗[10]通過(guò)臨床觀察，認(rèn)為青蒿鱉甲湯加減對(duì)于改善放化療所帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高生活質(zhì)量以及抑制轉(zhuǎn)移等方面具有良好效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從形態(tài)學(xué)上證實(shí)，加味青蒿鱉甲湯具有誘導(dǎo)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的作用，也進(jìn)一步闡明了，其可以通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的目的。表明加味青蒿鱉甲湯對(duì)于肺癌的療效，可兼顧臨床表現(xiàn)以及腫瘤本身，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。