祖師麻片對(duì)牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)研究

程 龍，張?zhí)祛＃婪?，馬 丹，宋敬怡，張仲毅，張碩峰*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.山海關(guān)藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 秦皇島市 066200）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征主要是手、足小關(guān)節(jié)的多關(guān)節(jié)、對(duì)稱性、侵襲性關(guān)節(jié)滑膜炎癥以及軟骨損傷[1]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)RA的發(fā)病機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)[2]。臨床治療RA的藥物有非甾體抗炎藥、抗風(fēng)濕藥和植物藥制劑等，然而，這些藥物長(zhǎng)時(shí)間服用具有嚴(yán)重的毒副作用，如胃腸道損傷、肝毒性以及增加心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)等[3-4]。

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香（Daphne giraldii Nitsche）、陜甘瑞香（Daphne tangutica Maxim）及凹葉瑞香（Daphne retusa Hemsl）的莖皮和根皮，具有祛風(fēng)通絡(luò)，散瘀止痛。研究發(fā)現(xiàn)，祖師麻具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[5-7]。祖師麻片[8]用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)，但其具體藥效機(jī)制尚不清楚。本研究采用牛Ⅱ 型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced anhritis，CIA）動(dòng)物模型，來觀察祖師麻片對(duì)CIA模型大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康6周齡SPF級(jí)Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。合格證號(hào)：11400700241427，11400700249067。所有大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[SYXK（京）2016-0038]，室溫（25±2）℃、45%相對(duì)濕度，12 h/12 h光暗周期，飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食及飲水。

1.2 試劑及藥品 祖師麻片購(gòu)于秦皇島市山海關(guān)藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為20160302；雷公藤多苷片購(gòu)于湖北千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20170302；戊巴比妥鈉購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)為020402；弗氏不完全佐劑購(gòu)于Sigma公司，批號(hào)為SLBQ2284V；牛II型膠原乳化劑購(gòu)于Biotopped公司，批號(hào)為C7806；COX-2 、CTGF、RF、IgG、IL-6、PGE-2、TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)于Bluegene公司，批號(hào)分別為20170728、20170728、20171023、20170820、20180302、20180302、2018030。

1.3 儀器 半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)徠卡（Leica）儀器有限公司）；正置智能型顯微鏡（奧林巴斯（中國(guó)）有限公司）；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物造模 參照文獻(xiàn)[9]方法，配制牛II型膠原乳化劑（每毫升乳劑含1 mg 牛II型膠原）。實(shí)驗(yàn)時(shí)，于大鼠自尾根部皮內(nèi)注射 0.1 mL 牛II型膠原乳劑，14 d后即第15天用同樣方法相同劑量再次加強(qiáng)注射第2次。正常對(duì)照組每次注射等劑量的生理鹽水。每周稱取一次體質(zhì)量并記錄。

1.4.2 CIA模型評(píng)價(jià) 從第2次注射牛II型膠原乳化液開始，每天觀察造模大鼠關(guān)節(jié)的紅腫程度，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)分（AI評(píng)分）。AI評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)[10]：0分：前爪和后足沒有腫脹和局部發(fā)紅；1分：個(gè)別足趾輕度紅腫；2分：踝關(guān)節(jié)或腕關(guān)節(jié)輕度腫脹；3分：前爪、后足和關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)炎；4分：前爪、后足畸形或關(guān)節(jié)僵硬。每只大鼠均做觀察評(píng)分，評(píng)分總和即為CIA大鼠的AI評(píng)分。每隔1天計(jì)算一次。

1.4.3 分組與給藥 第二次注射牛II型膠原乳化劑后7 d，選取60只AI＞2的大鼠，用隨機(jī)分配法分為模型組、雷公藤多苷片組（陽性對(duì)照組）、祖師麻腸溶制劑高、中、低劑量組組、每組12只。正常組12只。雷公藤多苷片，按體臨床人最大用量為1.5 mg/（kg·d），即大鼠受試劑量為臨床人用量的6倍，即給藥劑量為9 mg/（kg·d）；祖師麻片9.9 g生藥/人/d（按祖師麻片藥典內(nèi)容計(jì)算），按體質(zhì)量75 kg計(jì)算，即1.32×102mg生藥/kg，大鼠受試劑量分別為臨床用量的12、6、3倍，即1.584×103mg、7.92×102mg、3.96×102mg生藥/kg。上述藥品溶于羧甲基纖維鈉溶液，共灌胃給藥10 d，1次/d，正常組、模型組給予等量羧甲基纖維鈉溶液。

1.4.4 取材 在給藥10 d后取材。大鼠以1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心制備血清。沿后肢正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié)，剪斷膝關(guān)節(jié)，放入4%多聚甲醛固定液中固定。

1.4.5 ELISA法檢測(cè)測(cè)血清中生長(zhǎng)因子、免疫因子、風(fēng)濕因子及炎癥因子 ELISA法測(cè)定大鼠血清中CTGF、IgG、RF、COX-2、IL-6、PGE-2 和 TGF-α含量。

1.4.6 膝關(guān)節(jié)番紅O-固綠染色 取每組大鼠膝關(guān)節(jié)脫鈣后做石蠟切片，切片脫蠟至水；鐵蘇木素液染核；流水沖洗；靜水放置；番紅 O 染液滴染 ；95% 乙醇分化；自來水洗；60 ℃ 預(yù)熱固綠滴染；蒸餾水急洗一次；番紅 O 染液復(fù)染 ；95% 乙醇分化；自來水洗。鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨的一般形態(tài)，并對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行Mankin’s 評(píng)分。膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評(píng)分原則依據(jù)文獻(xiàn)[11]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 8.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 祖師麻片對(duì)CIA模型大鼠AI評(píng)分的影響 見表1。

2.2 祖師麻片對(duì)CIA模型大鼠血清中生長(zhǎng)因子、免疫因子及風(fēng)濕因子的影響 見圖1。

2.3 祖師麻片對(duì)CIA模型大鼠血清中炎癥因子的影響 見圖2。

表1 祖師麻片對(duì)CIA大鼠AI評(píng)分的影響（±s ，n =12）

注：與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 劑量/[mg/（kg·d）] 給藥前AI評(píng)分 給藥后AI評(píng)分2 d 4 d 6 d 8 d 10 d正常對(duì)照組 - 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0##模型組 - 6.7±1.0 6.4±1.4 6.1±1.4 6.0±0.8 5.8±0.7 5.3±1.5雷公藤多苷片組 9 6.4±1.3 5.6±1.3 5.4±1.2 4.9±0.9# 4.3±0.8## 3.3±1.0##祖師麻片組3.96×102 6.1±1.8 5.9±1.7 5.6±1.5 5.3±1.3 5.1±1.2 4.5±0.9#7.92×102 5.9±1.6 5.7±1.9 5.3±1.0 5.2±1.3 4.6±1.1# 3.7±1.4##1.584×103 6.3±1.2 5.5±1.4 5.4±1.2 4.9±1.1# 3.9±1.0## 3.6±1.0##

圖1 祖師麻片對(duì)CIA模型大鼠血清中生長(zhǎng)因子、免疫因子及風(fēng)濕因子的影響

圖2 祖師麻片對(duì)CIA大鼠血清中炎癥因子的影響

2.4 膝關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色 如圖3所示，各組大鼠膝關(guān)節(jié)番紅固綠染色比較，正常組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)果光整如常，軟骨細(xì)胞數(shù)量正常，軟骨著色正常，潮線完整（圖3A）。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)裂痕，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，染色重度減少，軟骨下骨血管入侵潮線（圖3B）。雷公藤多苷片組（圖3C）、祖師麻高（圖3D）、中（圖3E）、低（圖3F）劑量組軟骨細(xì)胞數(shù)量稍有減少，染色丟失較模型組少，潮線基本完整。

2.5 祖師麻片對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s 評(píng)分比較 見圖4。

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色（× 400）

圖4 祖師麻片對(duì)CIA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分比較

3 討論

牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（collagen-induced anhritis，CIA）動(dòng)物模型是研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎公認(rèn)的模型，在國(guó)際上已廣泛應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)研究和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎特效藥物的研究[12]。目前，RA的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依靠急性期反應(yīng)物和血清中相關(guān)因子（如：CTGF、RF、IgG等）含量多少及癥狀持續(xù)的長(zhǎng)短[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，祖師麻片高劑量組能顯著的降低大鼠血清中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、風(fēng)濕因子、免疫球蛋白G含量，提示祖師麻片可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫對(duì)RA起治療作用。AI評(píng)分是衡量RA的又一標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)[15]。本研究中，模型組大鼠前爪和后足紅腫、關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)炎，其AI評(píng)分與正常組比較顯著增加。環(huán)氧化物酶-2是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，是炎性細(xì)胞的前體的控制酶。非甾體抗炎藥物主要通過抑制COX-2的活性，從而阻斷AA的轉(zhuǎn)化，繼而降低PGE的大量生成，發(fā)揮抗炎作用[16]。IL-6是在感染和炎癥反應(yīng)中顯著上調(diào)的細(xì)胞因子，在RA發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞和關(guān)節(jié)周圍結(jié)構(gòu)的破壞，此外，IL-6也參與B淋巴細(xì)胞的成熟、產(chǎn)生自身抗體等，造成患者關(guān)節(jié)的病變[17]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是RA發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的致炎因子，誘導(dǎo)滑膜增生、軟骨/骨破壞和全身炎癥反應(yīng)，且在RA發(fā)作后TNF-α水平顯示出“晝高、夜低”的24 h節(jié)律性變化[18]。本研究中，模型組大鼠血清中炎癥因子COX-2、IL-6、PGE-2、TNF-a含量顯著增加，膝關(guān)節(jié)軟骨表面出現(xiàn)裂痕，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，染色重度減少，軟骨下骨血管入侵潮線，Mankin’s評(píng)分顯著增加。祖師麻片不同劑量干預(yù)后，其AI評(píng)分及血清中COX-2、PGE-2、IL-6、TNF-α的含量顯著降低，可減輕CIA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)破壞的范圍和嚴(yán)重程度，并具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增生的作用。祖師麻片不同劑量給藥組Mankin’s評(píng)分顯著降低也證實(shí)了其保護(hù)軟骨損傷的作用。

綜上所述，祖師麻片對(duì)Ⅱ 型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有顯著改善作用，在治療RA具有重要價(jià)值，其機(jī)制可能與抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。但其更深入的機(jī)制尚未完全清楚，因此，進(jìn)而研究更深層次的機(jī)制具有重要的意義。