幾株百菌清敏感海洋發(fā)光細(xì)菌的分類地位分析

段效輝，張群，李金慶，劉鵬，王文雯，王穎

（1.煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東煙臺(tái)264000；2.濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東濟(jì)南250000）

海洋環(huán)境的特異性帶來了海洋微生物在物種和生態(tài)功能上的多樣性，其中的發(fā)光細(xì)菌就是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見熒光（熒光波長(zhǎng)在450 nm～490 nm）的細(xì)菌，該類細(xì)菌在黑暗處肉眼可辨[1]。近年來，學(xué)者根據(jù)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的變化與外來受試物的毒性大小有一定相關(guān)性，在各種環(huán)境監(jiān)測(cè)中把發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度作為測(cè)定環(huán)境中有毒物質(zhì)的指標(biāo)，與其它檢測(cè)方法相比具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，近年來已被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境生物毒素檢測(cè)[2-3]，環(huán)境樣品毒性測(cè)試[4-6]，食品安全性檢測(cè)[7]，致癌物質(zhì)生物毒性檢測(cè)[8]等方面。

百菌清是一種廣譜性殺菌劑，有多重劑型，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。由于其對(duì)植物體具有的良好黏著特性，且本身降解速度較慢，而大量殘留于果蔬、土壤以及水環(huán)境中[9-10]。百菌清在環(huán)境中的累積效應(yīng)，可對(duì)魚類、鳥類等動(dòng)物產(chǎn)生高毒性，也可對(duì)人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成較大干擾[11]。

目前氣相色譜法和液相色譜法是用于百菌清檢測(cè)的兩種主要方法，但由于方法前處理復(fù)雜、需要儀器昂貴等原因，而使得其應(yīng)用具有一定的局限性[12-14]。

發(fā)光細(xì)菌對(duì)污染物生物毒性的高度敏感和易于檢測(cè)，使發(fā)光細(xì)菌分析法成為一種簡(jiǎn)便、靈敏、快速的急性毒性檢測(cè)方法。目前國(guó)內(nèi)外發(fā)光細(xì)菌法大多用來監(jiān)測(cè)環(huán)境、土壤、水質(zhì)等的急性毒性，用于食品中多菌靈、氯霉素等農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)及毒性評(píng)價(jià)也得到一定發(fā)展[15]。

本文從海洋生物中篩選對(duì)百菌清敏感的發(fā)光細(xì)菌，同時(shí)利用形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA 序列測(cè)定、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified ribosome DNA restriction analysis，ARDRA）分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法，對(duì)從青島海域新鮮海魚中分離純化得到的發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)、分子鑒定及分類地位分析，為后續(xù)開展海洋發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)百菌清方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

發(fā)光細(xì)菌固體培養(yǎng)基：甘油3 mL，酵母粉5 g，胰蛋白胨5 g，碳酸鈣1 g，瓊脂20 g，陳海水1 000 mL，pH7.8～8.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)光細(xì)菌液體培養(yǎng)基：酵母粉5 g，胰蛋白胨5 g，氯化鈉30 g，磷酸氫二鈉5 g，磷酸二氫鉀1 g，甘油3 mL，pH 7.6，121 ℃滅菌20 min。

海水2216E 瓊脂斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸鐵0.01 g，瓊脂20 g，陳海水1 000 mL，pH 7.6，121 ℃滅菌20 min。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）：煙臺(tái)出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買并保存。

1.2 主要試劑和儀器

27F 和1492R 16S rDNA 序列上下游引物、DNA Marker、Ex Taq 酶及限制性內(nèi)切酶AfaⅠ、MspⅠ：寶生物工程（大連）有限公司；GoTaqGreen Master Mix 溶液：美國(guó)普洛麥格（Promega）公司；革蘭氏染色試劑盒：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Epgradient PCR 擴(kuò)增儀：德國(guó)艾本德（Eppendorf）股份公司；Universal Hood Ⅱ凝膠成像儀：美國(guó)伯樂（Bio-Rad）公司；ALB128 金屬?。好绹?guó)賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）；Centrifuge 5417R 高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德（Eppendorf）股份公司；SPARK 10M 酶標(biāo)儀：美國(guó)帝肯（TECAN）貿(mào)易有限公司。

1.3 發(fā)光細(xì)菌的分離與純化

將青島市前灣漁碼頭新鮮捕獲的海魚，于無菌環(huán)境下，用無菌3%NaCl 溶液沖洗魚體表雜物后，用滅菌鑷子、解剖刀分別采集5 片～6 片魚鱗、全部魚鰓、大部分魚腸（用解剖刀剖開魚腸，使內(nèi)容物可以流出），然后分別放入含有玻璃珠的45 mL 無菌3%NaCl 溶液，并置于渦旋震蕩器上振蕩2 min～3 min，充分混勻后放置于無菌超凈臺(tái)中備用。在無菌超凈臺(tái)中，用移液槍向傾注有發(fā)光細(xì)菌固體培養(yǎng)基的平板中注入800 μL 3%NaCl 溶液，分別吸取混勻后的200 μL 魚鱗、魚鰓、魚腸懸液同樣注入到平板培養(yǎng)基中，再用涂布棒涂布均勻，一式兩份，做好標(biāo)記。將處理好的平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)，直到有菌落生成，取出，置于暗室觀察，對(duì)發(fā)出熒光的菌落做好標(biāo)記，編號(hào)。用接種針挑取標(biāo)記好的發(fā)光菌落，進(jìn)行連續(xù)劃線接種，直到得到可在暗室發(fā)出熒光的純菌落。

1.4 發(fā)光細(xì)菌對(duì)百菌清敏感性的篩選

1.4.1 百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

采用杯碟法篩選生長(zhǎng)特性對(duì)百菌清敏感的海洋發(fā)光細(xì)菌。分離到的海洋發(fā)光細(xì)菌接種于2216E 平板，于28 ℃培養(yǎng)24 h 后，以無菌生理鹽水制成均勻懸液，至OD600nm=0.5，約106CFU/mL。吸取菌懸液0.2 mL 涂布于2216E 平板，靜置1 min 后，放置4 個(gè)滅菌的牛津杯于平板上，每個(gè)牛津杯間隔一定的距離。將其中3個(gè)牛津杯中加入濃度為5 mg/L 的百菌清溶液100 μL，最后一個(gè)加入無菌水100 μL 做對(duì)照。將平板小心放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察記錄抑菌圈直徑大小。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判斷菌株對(duì)百菌清的敏感程度。抑菌圈直徑越大，則發(fā)光細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)百菌清的敏感性越強(qiáng)。

1.4.2 百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

制備不同濃度的百菌清溶液，分別與過夜培養(yǎng)的發(fā)光細(xì)菌懸液反應(yīng)，以酶標(biāo)儀測(cè)定百菌清作用前后發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制效率，抑制率高，則敏感性好。按照下面的公式計(jì)算百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制效率：

式中：X為發(fā)光抑制效率，%；Kc為未添加百菌清溶液中發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度；Kt為待測(cè)溶液中發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度。

發(fā)光抑制效率越大，則發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光對(duì)百菌清的敏感性越強(qiáng)。

1.5 發(fā)光細(xì)菌的鑒定

1.5.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板的制備

取過夜培養(yǎng)的發(fā)光細(xì)菌菌懸液3 μL 轉(zhuǎn)入裝有100 μL 滅菌雙蒸水的1.5 mL 離心管中，在99 ℃水浴10 min，10 000 g 離心10 min，冷卻后取上清液作為PCR 反應(yīng)模板。

1.5.2 16S rDNA PCR 擴(kuò)增

發(fā)光細(xì)菌16S rDNA PCR 擴(kuò)增所用引物為細(xì)菌16S rDNA 通用引物，上游引物27F：5’-AG

AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）為：GoTaq Green Master Mix 12.5 μL，上游引物27F 1 μL，下游引物1492R 1 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 16S rDNA PCR產(chǎn)物ARDRA 分析

采用兩種限制性內(nèi)切酶Afa I、Msp I 對(duì)發(fā)光細(xì)菌16S rDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行同步雙酶切，酶切反應(yīng)體系（20 μL）為：PCR產(chǎn)物8 μL，內(nèi)切酶各1 μL，10×Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，去離子水6 μL。37 ℃恒溫3 h 后，酶切產(chǎn)物加2 μL 10×loading Buffer 終止反應(yīng)。取酶切產(chǎn)物10 μL 用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 16S rDNA PCR產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

16S rDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序。測(cè)序所得基因序列提交到NCBI 網(wǎng)站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）進(jìn)行Blast 比對(duì)。采用MEGA 5.05 軟件以Neighborjoining 統(tǒng)計(jì)方法自展1 000 次進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)光細(xì)菌的分離及形態(tài)觀察

經(jīng)分離純化培養(yǎng)后共獲得17 株發(fā)光細(xì)菌見表1。

表1 發(fā)光細(xì)菌在魚體寄生部位Table 1 Parasitic position of luminous bacteria in fresh sea fish

17 株細(xì)菌均在暗室中發(fā)出明亮的藍(lán)綠色可見光，具有發(fā)光特性；革蘭氏陰性菌；在發(fā)光固體培養(yǎng)基上菌落為圓形類似饅頭狀，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊或呈鋸齒狀；油鏡下觀察，呈桿狀或弧狀。在魚鱗、魚鰓和魚腸中均分離獲得發(fā)光細(xì)菌。其中生物體腸道內(nèi)分離獲得發(fā)光細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較多，是分離發(fā)光細(xì)菌的重要資源。

2.2 發(fā)光細(xì)菌對(duì)百菌清敏感性測(cè)試

有毒有害物質(zhì)對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的影響可分為通過細(xì)胞質(zhì)毒性抑制細(xì)胞代謝過程和直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶的活性兩種方式[16]。本部分從生長(zhǎng)和發(fā)光兩方面測(cè)定發(fā)光細(xì)菌對(duì)百菌清的敏感特性。

2.2.1 百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

根據(jù)我國(guó)食品中農(nóng)藥最大殘留限量規(guī)定[17]，菠菜、黃瓜等蔬菜以及西瓜、甜瓜中百菌清限量一般為5 mg/L，而日本果蔬農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)中，百菌清在葉菜中的殘留要求在1 mg/L～6 mg/L。本試驗(yàn)遂選取濃度為5 mg/L 的百菌清溶液利用杯碟法從分離得到的17 株發(fā)光細(xì)菌中篩選百菌清敏感株。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)與指南，大多數(shù)情況下，抑菌圈直徑在13 mm 以上的情況，說明菌株對(duì)該抗生素敏感。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百菌清可抑制多株發(fā)光細(xì)菌的生長(zhǎng)，排除重復(fù)分離株，有6株發(fā)光細(xì)菌的抑菌圈直徑超過了13 mm，抑菌圈直徑最高可達(dá)25 mm，較低的一株Ft-2-1 也在16 mm，具體結(jié)果見表2。

表2 百菌清對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Influence of chlorothalonil to the growth of each strain

2.2.2 百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的影響

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度能夠在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)某些有害物質(zhì)呈現(xiàn)一定比例關(guān)系，是用于有害因子檢（監(jiān)）測(cè)的重要依據(jù)。制備不同濃度的百菌清溶液，與發(fā)光細(xì)菌反應(yīng)，測(cè)定百菌清溶液對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制情況，測(cè)定發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光對(duì)百菌清的敏感特性，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示，對(duì)百菌清具有生長(zhǎng)敏感特性的6株發(fā)光細(xì)菌，其發(fā)光強(qiáng)度也受到百菌清不同程度的影響，但不具備一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。其中抑菌圈直徑相對(duì)較低的菌株Ft-2-1，其發(fā)光強(qiáng)度受到百菌清較大影響，65%以上的發(fā)光強(qiáng)度被抑制。相反的，抑菌圈直徑最大的菌株Fc-12-1-1，其發(fā)光抑制效率都小于20%，菌株Fw-1-1 也表現(xiàn)出類似特性。菌株Fc-12-2 和Fc-14-1-1 在較強(qiáng)的生長(zhǎng)敏感性的同時(shí)也表現(xiàn)出較好的發(fā)光敏感性，其發(fā)光抑制率都達(dá)到了60%。在6株發(fā)光細(xì)菌中，菌株Ff-2-2 對(duì)百菌清的敏感特性較穩(wěn)定，同時(shí)具備了生長(zhǎng)和發(fā)光敏感特征，且其發(fā)光強(qiáng)度同百菌清濃度呈現(xiàn)較好的線性比例關(guān)系。

圖1 百菌清對(duì)菌株發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.1 Influence of chlorothalonil to the fluorescence intensity of each strain

2.3 發(fā)光細(xì)菌16S rDNA序列ARDRA分析

研究表明，每一個(gè)菌種的16S rDNA 限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性類型都有一個(gè)獨(dú)特的酶切圖譜，代表了一個(gè)操作分類單位（即OTU），用16S rDNA 序列進(jìn)行ARDRA 分析可以區(qū)分出細(xì)菌種的差異[18]，該技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。本部分選用限制性內(nèi)切酶AfaⅠ和MspⅠ對(duì)6株百菌清敏感發(fā)光細(xì)菌16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切分析，其結(jié)果見圖2。

圖2 16S rDNA PCR產(chǎn)物ARDRA 分析圖譜Fig.2 ARDRA analysis maps of 16S rDNA PCR products

根據(jù)圖2 中的限制性酶切圖譜，6株菌株共分為3個(gè)不同的OTUs，其中OTU1 包括菌株Ft-2-1、Fc-12-1、Fc-14-1-1 和Fc-12-2，OTU2 僅有菌株Ff-2-2，OTU3 僅有菌株Fw-1-1。

2.4 16S rDNA 序列測(cè)定結(jié)果

發(fā)光細(xì)菌的16S rDNA 序列測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 6株發(fā)光細(xì)菌的16S rDNA 序列相似性比較Table 3 Similarity of 16S rDNA sequences from 6 luminous bacteria

結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果及試驗(yàn)菌株16S rDNA 序列的最高相似性可得知，6株百菌清敏感發(fā)光細(xì)菌分別為費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）、黑美人弧菌（Vibrio nigripulchritudo）、長(zhǎng)牡蠣弧菌（Vibrio crassostreae）、依氏假交替單胞菌（Pseudoalteromonas issachenkonii）、明亮發(fā)光桿菌（Photobacterium phosphoreum）、Vibrio toranzoniae。

2.5 16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

6株發(fā)光細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果如圖3顯示。

6株發(fā)光菌株分別與Vibrio fischeri、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio crassostreae、Pseudoalteromonas is－sachenkonii、Photobacterium phosphoreum、Vibrio toranzoniae具有最近的親緣關(guān)系，其中菌株Fc-12-1-1、Fc-14-1-1、Ft-2-1、Fc-12-2 親緣關(guān)系較近，這與16S rDNA序列ARDRA 分析相一致。菌株Ff-2-2 與Fw-1-1 雖然ARDRA 分析結(jié)果顯示兩者分屬于兩個(gè)分類單位，但系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示二者親緣關(guān)系也較為接近，這可能與本研究中選擇的限制性內(nèi)切酶有關(guān)[18-19]。

圖3 6株發(fā)光細(xì)菌的16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果Fig.3 Phylogenetic tree analysis results of 16S rDNA sequences from 6 luminous bacteria

3 討論和結(jié)論

從青島海域新鮮海魚的魚鱗、魚鰓、魚腸中分離獲得17 株海洋發(fā)光細(xì)菌，從生長(zhǎng)和發(fā)光兩個(gè)方面研究了發(fā)光細(xì)菌對(duì)百菌清的敏感特性。利用形態(tài)學(xué)觀察、16S rDNA 序列測(cè)定、ARDRA 分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法，對(duì)分離純化得到的發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育地位分析。確定了6株百菌清敏感發(fā)光細(xì)菌及其分類地位。

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)與指南，抑菌圈直徑在13 mm 以上時(shí)表明微生物對(duì)該抗生素敏感。本文篩選的6株發(fā)光細(xì)菌受百菌清的抑制，抑菌圈直徑在16 mm～25 mm 之間，對(duì)百菌清表現(xiàn)出較好的敏感特性。6株發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度也受到百菌清不同程度的影響，但與生長(zhǎng)敏感特性不呈現(xiàn)正比例關(guān)系。其中，菌株Fc-12-1-1 受百菌清抑制，抑菌圈高達(dá)25 mm，而其發(fā)光強(qiáng)度則最高僅被抑制約20%，而菌株Ft-2-1 的抑菌圈直徑在16 mm，對(duì)百菌清的生長(zhǎng)敏感特性明顯低于菌株Fc-12-1-1，其發(fā)光強(qiáng)度則被抑制65%以上，大大高于百菌清對(duì)菌株Fc-12-1-1 的發(fā)光抑制。這一結(jié)果說明，百菌清對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的抑制效應(yīng)并不是主要通過抑制生長(zhǎng)來產(chǎn)生的。這很可能是由于百菌清直接抑制參與發(fā)光反應(yīng)的酶的活性而不是通過細(xì)胞質(zhì)毒性抑制細(xì)胞代謝過程[16]。

分離的6株百菌清敏感海洋發(fā)光細(xì)菌，4 株屬于弧菌屬，分別是Vibrio fischeri、Vibrio nigripulchritudo、Vibrio crassostreae和Vibrio toranzoniae，另2株分別屬于假單胞菌屬（Pseudoalteromonas issachenkonii）和發(fā)光桿菌屬（Photobacterium phosphoreum）。其中，Vibrio fischeri（費(fèi)氏弧菌）已作為水質(zhì)急性毒性監(jiān)測(cè)指標(biāo)微生物在水質(zhì)安全監(jiān)控中發(fā)揮了重要作用[20-21]，Photobacterium phosphoreum（明亮發(fā)光桿菌）以及Photobacterium leiognathi（鰒發(fā)光桿菌）也在食品安全檢測(cè)中得到了一定的應(yīng)用[15，22]。但此次分離的所有發(fā)光細(xì)菌，都未見有報(bào)道用于百菌清檢（監(jiān)）測(cè)的應(yīng)用，有益的補(bǔ)充了用于食品安全檢（監(jiān)）測(cè)的發(fā)光細(xì)菌菌株資源。

用于食品安全檢測(cè)的發(fā)光細(xì)菌一般包括淡水和海水兩種。由于淡水的發(fā)光細(xì)菌資源有限，目前用于食品安全檢測(cè)的僅有青?；【葞追N[7]，用于食品安全的檢測(cè)受到一定限制。而海水發(fā)光細(xì)菌則包括了多種弧菌及明亮發(fā)光桿菌、海氏交替單胞菌等，從海水中分離更多的發(fā)光細(xì)菌用于食品安全研究，是一項(xiàng)重要的途徑。本文分離的6株海洋發(fā)光細(xì)菌，正是現(xiàn)有發(fā)光細(xì)菌資源的有益補(bǔ)充，同時(shí)基于其發(fā)光強(qiáng)度隨百菌清濃度的增大而降低，發(fā)光抑制效率在10%～80%之間的敏感特性，有望用于百菌清的定量檢測(cè)。