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    黑螵蛸多糖的制備及活性測定

    2019-04-12 05:32:00梅桂雪王曉靜
    食品與藥品 2019年2期
    關(guān)鍵詞:膽堿酯酶自由基多糖

    梅桂雪,孫 捷,王曉靜*

    (1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南 250200;2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所,山東 濟(jì)南 250062;3.國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省罕少見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250062)

    黑螵蛸是螳螂科昆蟲巨斧螳螂(Hierodula patelliferServille)的干燥卵鞘,與團(tuán)螵蛸、長螵蛸統(tǒng)稱為桑螵蛸,是我國傳統(tǒng)的昆蟲類中藥材之一[1]。桑螵蛸入藥性平,味苷、咸,有補(bǔ)腎、助陽、固精、縮尿等功能,主治腎陽不足、遺精、陽萎、早泄、白濁、赤白帶下、小便頻數(shù)、遺尿等癥[2]。桑螵蛸多與其他中藥配伍,用于治療小兒遺尿等癥[3]。桑螵蛸其化學(xué)成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、脂類等[4]。目前桑螵蛸的研究主要集中在團(tuán)螵蛸,從團(tuán)螵蛸植物源成分中分離得到二萜、黃酮等化合物[5];桑螵蛸具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性,粗提物對四氧嘧啶糖尿病小鼠有良好的治療作用[6],揮發(fā)油提取物對金黃色葡萄球菌有一定的體外抑菌效應(yīng)[7]。就目前情況來看,對于黑螵蛸的研究較少,且未見黑螵蛸多糖提取分離、抗氧化、抗菌和抑制膽堿酯酶活性的研究報(bào)道。

    多糖廣泛存在于微生物、動(dòng)植物中,由于其各種生物學(xué)功能而受到營養(yǎng)和生化科學(xué)家的關(guān)注[8]。另外,已被報(bào)道的多糖大多無毒、副作用少,可潛在用于食品醫(yī)藥和化妝品行業(yè)[9]。多糖的藥理活性包括抗氧化、抗菌、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)和抗病毒[10-11]。多糖具有生物相容性,被認(rèn)為是重要的膳食自由基清除劑,主要用于防止氧化損傷[12]。有關(guān)多糖的報(bào)道中,未見多糖抑制膽堿酯酶的研究。膽堿酯酶是一類糖蛋白,分為乙酰膽堿酯酶(AChE)和丁酰膽堿酯酶(BuChE),二者共同調(diào)節(jié)乙酰膽堿的分解,影響神經(jīng)信號的傳遞,雙重膽堿酯酶抑制劑是目前最普遍認(rèn)可的阿爾茨海默病(AD)治療手段。因此尋找AChE和BuChE的雙重抑制劑成為AD治療的新策略[13]。

    本實(shí)驗(yàn)采用水提-醇沉法制備黑螵蛸粗多糖,經(jīng)DEAE Sephadex A-25離子交換柱色譜和Sephadex G-75凝膠柱色譜得到均一的黑螵蛸多糖組分。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羥基自由基清除法測定黑螵蛸多糖的抗氧化能力。采用貼片法測定多糖的抑菌圈,二倍稀釋法測定其最小抑菌濃度。采用5,5’-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法測定多糖AChE和BuChE抑制活性,為黑螵蛸多糖進(jìn)一步研發(fā)成新的抗氧化劑、抑菌劑和膽堿酯酶雙重抑制劑提供理論依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    1.2 ZX-LGJ-1型真空冷凍干燥機(jī)(上海知信儀器); LD25-2型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);U-3000型紫外可見分光光度計(jì)(日本日立);Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司);Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜儀(英國Malvern公司);中低壓制備型液相色譜儀(博納艾杰爾公司);XS105型分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);THZ-103B 恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒); BMJ-160型培養(yǎng)箱(蘇州賽恩斯);LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械)。

    1.2 材料

    黑螵蛸購自安國市啟航中藥材銷售有限公司,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉訓(xùn)紅教授鑒定,樣本為巨斧螳螂(Hierodula patelliferServille)的干燥卵鞘黑螵蛸。大腸埃希菌,金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌由山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院提供。

    DPPH(美國Sigma公司);維生素C(國藥集團(tuán));碘化乙酰硫代膽堿,碘化丁酰硫代膽堿,十二烷基硫酸鈉,乙酰膽堿酯酶(來源于電鰻魚),多奈哌齊(上海麥克林);5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB),丁酰膽堿酯酶(來源于馬血清)(上海阿拉丁);牛肉膏,蛋白胨(北京奧博星公司);青霉素-鏈霉素雙抗(索萊寶);DEAE Sephadex A-25,Sephadex G-75(源葉生物);氯化鈉,三氯甲烷,正丁醇,無水乙醇等化學(xué)試劑均為分析純(天津富宇精細(xì)化工)。

    2 方法

    2.1 黑螵蛸粗多糖的提取

    采用水提-醇沉淀的方法提取黑螵蛸多糖[14]:將黑螵蛸樣品置入60 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥處理,用高速多功能粉碎機(jī)粉碎,備用,按料液比1:10加入蒸餾水,90 ℃加熱煮沸5~10 h,過濾,濾渣反復(fù)浸提3次后合并濾液,濃縮至一定體積,加入4倍體積的無水乙醇,攪拌均勻后于4 ℃沉淀過夜。3000 r/min離心15 min,收集沉淀,無水乙醇洗滌沉淀至醇溶液無色,將沉淀置于通風(fēng)處揮發(fā)至無醇味,得黑螵蛸粗多糖,備用。采用Sevag[15]法除蛋白,將粗多糖加適量水溶解,加入等體積的由三氯甲烷:正丁醇(4:1,v/v)混合的Sevag液,于分液漏斗中混合震蕩后靜置,反復(fù)萃取除去蛋白質(zhì),上層多糖水溶液冷凍干燥后即得脫蛋白后的粗多糖。

    2.2 黑螵蛸多糖的分離純化

    用離子交換色譜(DEAE Sephadex A-25)和凝膠過濾色譜(Sephadex G-75)分離純化黑螵蛸粗多糖。將凍干的粗多糖粉末溶解于蒸餾水中,用DEAE Sephadex A-25中壓制備柱(2.6 cm×46 cm)進(jìn)行分離純化,依次用蒸餾水和0.05~1 mol/L氯化鈉溶液以1 ml/min的流速連續(xù)洗脫,自動(dòng)部分收集器收集洗脫液(每管3 ml),采用硫酸-苯酚法[16]跟蹤監(jiān)測,以試管號為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線,依據(jù)曲線,合并同一洗脫峰的各管洗脫液,冷凍干燥,得到多糖組分。用Sephadex G-75(2.6 cm×96 cm)中壓制備柱進(jìn)一步純化多糖,用蒸餾水以1 ml/min的流速洗脫,每管5 ml,繪制洗脫曲線,合并同一洗脫峰的各管洗脫液,將得到的精制多糖組分冷凍干燥。

    2.3 黑螵蛸多糖組分的紫外光譜分析

    稱取多糖精制樣品適量,配制成1 mg/ml水溶液,采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行全波長(190~900 nm)掃描,觀察圖譜是否有吸收峰。

    2.4 黑螵蛸多糖相對分子質(zhì)量(Mr)的測定

    采用凝膠滲透色譜測定多糖Mr,示差光檢測器監(jiān)測。儀器:Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜儀;色譜柱:AGuard+1xA6000M;流動(dòng)相:0.1 mol/L NaNO3+0.02% NaN3;流速:0.7 ml/min;檢測器溫度:35 ℃;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:100 μl。

    2.5 黑螵蛸多糖的抗氧化活性檢測

    2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定[17]精密稱取DPPH樣品10 mg,用無水乙醇溶解,定容于250 ml棕色量瓶(濃度0.1 mmol/L),0~4 ℃避光保存。試管中加入DPPH溶液2 ml,樣品溶液1 ml,室溫下避光靜置30 min,測定517 nm處吸光度Ai;以蒸餾水1 ml代替樣品溶液1 ml測得吸光度A0;以無水乙醇2 ml代替DPPH溶液2 ml測得吸光度Aj;每個(gè)樣品做3個(gè)平行,按以下公式計(jì)算清除率。

    DPPH自由基清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

    以半數(shù)抑制率(IC50)表示DPPH自由基清除能力,提取物的IC50值越小,表示其抗氧化能力越強(qiáng)。

    2.5.2 羥基自由基清除能力測定[18-19]分別取1 mmo1/L FeS04(用10 mmoL/L H2SO4溶液配置),1 mmo1/L水楊酸(用無水乙醇配置),0.03%H2O21 ml于10 ml試管中,再加入1 ml不同濃度的樣品溶液。以1 ml 0.3% H2O2啟動(dòng)反應(yīng),3 ℃水浴30 min,以蒸餾水作為空白對照,維生素C作為陽性對照,測定510 nm處反應(yīng)液的吸光值A(chǔ)1。以1 ml蒸餾水代替樣品溶液測得吸光度A0;以1 ml無水乙醇代替水楊酸測得吸光度A2;每個(gè)樣品做3個(gè)平行,按以下公式計(jì)算清除率(IC50)。

    羥基自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

    2.5.3 數(shù)據(jù)處理 用IBM SPSS Statistics 22.0軟件對結(jié)果進(jìn)行方差分析,比較各組實(shí)驗(yàn)效果。

    2.6 黑螵蛸多糖的抗菌活性測定

    稱取適量黑螵蛸精制多糖樣品,用蒸餾水配制成50 μg/ml的溶液,無菌過濾器過濾除菌,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(加瓊脂)倒入培養(yǎng)皿中,冷卻備用。倒取適量牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(不加瓊脂)于試管中,接種環(huán)沾取菌株于試管中,37 ℃、100 r/min于恒溫培養(yǎng)搖床中培養(yǎng)。待培養(yǎng)基變渾濁(有菌生長)后,吸取少許菌懸液于固體培養(yǎng)基上,涂布器均勻涂布,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將浸潤黑螵蛸多糖、青霉素和鏈霉素的濾紙片(每個(gè)濾紙片直徑6 mm) 貼在已涂布菌種的培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)18~24 h。觀察抑菌圈的有無及其大小,即可判斷其敏感性,統(tǒng)計(jì)抑菌圈直徑。抑菌效果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:D≤8 mm為不敏感,8 mm<D≤13 mm為低度敏感,13 mm<D≤19 mm為中度敏感,D>19 mm為高度敏感),采用二倍稀釋法[20]測定有抑菌效果樣品的最小抑菌濃度(MIC)。

    2.7 黑螵蛸多糖膽堿酯酶抑制活性測定

    2.7.1 AChE抑制活性測定 采用改良的Ellman方法[21]測定AChE抑制活性。用PBS(pH 8.0,0.1 mol/L)配制濃度為0.2 U/ml乙酰膽堿酯酶溶液(50 mg酶用水定容到50 ml),0.75 mmol/L DTNB溶液,1.5 mmol/L碘化乙酰硫代膽堿,3%SDS終止液。依次向試管中加入 PBS(pH 8.0,0.1 mol/L)2.65 ml,DTNB 100 μl、不同濃度的樣品100 μl、酶溶液50 μl,37 ℃水浴中預(yù)熱5 min,加入底物100 μl,37 ℃水浴溫浴20 min,迅速加入3%SDS 1 ml終止反應(yīng),測定412 nm處吸光度A1。以100 μl 甲醇代替樣品溶液測得吸光度A0;以100 μl PBS代替底物測得吸光度A2;按下式計(jì)算AChE半數(shù)抑制率(IC50)。

    AChE抑制率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

    2.7.2 BuChE抑制活性測定 采用改良的Ellman方法,具體操作步驟與AChE測定方法相同。只是將AChE抑制活性測定中的底物碘化乙酰硫代膽堿替換成碘化丁酰硫代膽堿,其他反應(yīng)溶液配制和具體操作步驟與AChE抑制活性測定時(shí)相同。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 黑螵蛸多糖提取與分離

    黑螵蛸多糖經(jīng)DEAE Sephadex A-25陰離子交換柱分離,硫酸-苯酚法檢測,得到2個(gè)單一洗脫峰,洗脫曲線見圖1。洗脫峰1是水洗脫產(chǎn)物,為中性多糖。洗脫峰2是鹽洗脫產(chǎn)物,為酸性多糖。合并峰1、峰2,冷凍干燥,峰2的量不足5 mg不作為重點(diǎn)研究對象。峰1為主要組分,命名為H-1。

    圖1 黑螵蛸多糖DEAE Sephadex A-25色譜柱洗脫曲線

    H-1經(jīng)Sephadex G-75凝膠分子篩純化,洗脫曲線見圖2。洗脫后得到對稱單峰,命名為HPP-1,初步說明獲得了Mr均一的多糖組分。

    圖2 黑螵蛸多糖H-1經(jīng)DEAE Sephadex G-75色譜柱純化洗脫曲線

    3.2 黑螵蛸多糖紫外光譜分析

    黑螵蛸精制多糖HPP-1紫外掃描結(jié)果見圖3。由圖3可見,該多糖在200 nm處有多糖吸收峰。核酸的特征吸收波長為260 nm,蛋白質(zhì)的特征吸收波長為280 nm,色素的特征吸收波長為620 nm,圖3顯示該多糖在以上3個(gè)波長處均無吸收峰,表明HPP-1不含核酸、蛋白質(zhì)和色素。

    圖3 HPP-1的紫外掃描光譜

    3.3 黑螵蛸多糖Mr的測定

    對精制黑螵蛸多糖進(jìn)行凝膠滲透色譜分析,示差光檢測器檢測,經(jīng)儀器計(jì)算得黑螵蛸精制多糖Mr為13 048。

    3.4 黑螵蛸多糖的抗氧化活性

    黑螵蛸多糖HPP-1的DPPH自由基和羥基自由基清除活性測定結(jié)果見表1。由表1可見,HPP-1對DPPH自由基有清除作用,但清除能力稍弱于維生素C。HPP-1對羥基自由基清除能力較強(qiáng),強(qiáng)于陽性對照維生素C。羥基自由基能與體內(nèi)的脂類、蛋白質(zhì)、核酸、多肽等物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),對體內(nèi)的生物大分子有很強(qiáng)的氧化破壞效應(yīng),對細(xì)胞和組織產(chǎn)生氧化損傷,引起組織器官病變,導(dǎo)致機(jī)體衰老[22]。黑螵蛸多糖HPP-1羥基自由基清除能力較強(qiáng),能阻止其與生物體內(nèi)的生物大分子發(fā)生反應(yīng),減輕氧化破壞效應(yīng)引起的細(xì)胞與組織損傷。

    表1 HPP-1的抗氧化活性

    3.5 黑螵蛸多糖的抗菌活性

    HPP-1對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性測定結(jié)果見表2,以稀釋200倍的青霉素-鏈霉素雙抗作為陽性對照。由表2可見,HPP-1對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑小于8 mm,屬于不敏感,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無抑制作用。HPP-1對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑大于19 mm,屬于高度敏感,抗菌作用最強(qiáng)。HPP-1對枯草芽孢桿菌的MIC為18.8 μg/ml。

    表2 HPP-1的抗菌活性

    3.6 黑螵蛸多糖的膽堿酯酶抑制活性

    AChE抑制活性測定基本原理是以碘化乙酰硫代膽堿為底物,其在AChE的作用下發(fā)生分解反應(yīng)生成硫代膽堿,與顯色劑DTNB迅速反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯乙酸,該物質(zhì)在412 nm處有可見光吸收。若待測提取物對AChE有抑制作用,則反應(yīng)產(chǎn)物吸收度降低。具體測定結(jié)果見表3。由表3可見,HPP-1對AChE和BuChE均有抑制活性。

    表3 HPP-1的AChE和BuChE抑制活性

    4 結(jié)論

    采用水提-醇沉方法提取黑螵蛸粗多糖,經(jīng)DEAE Sephadex A-25離子交換柱色譜和Sephadex G-75凝膠柱色譜分離純化得到均一的黑螵蛸多糖組分HPP-1,Mr為13 048,且多糖純度較高,不含核酸、蛋白質(zhì)和色素。HPP-1對DPPH自由基和羥基自由基均有清除活性,其中羥基自由基清除活性強(qiáng)于陽性對照維生素C,對枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抑制活性,表明黑螵蛸多糖在天然抗氧化劑、抗菌劑方面有極大的開發(fā)潛力。另外實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)HPP-1對AChE和BuChE均有抑制活性。目前批準(zhǔn)上市的膽堿酯酶抑制劑都伴隨不同程度的毒副作用,多糖類藥物來源廣泛,具有多種生物學(xué)活性,安全無毒副作用,且藥物質(zhì)量通過化學(xué)手段容易控制,因此,多糖類藥物成為當(dāng)今功能保健品和綠色食品添加劑研究的一大熱點(diǎn)。

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