新疆長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原鑒定

方治豪，海 艷，王凱濤，李 妍，任毓忠

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

長(zhǎng)藥八寶[Hylotelephiumspectabile(Bor.)H.Ohba]，原名長(zhǎng)藥景天(Sedumspectabile)，別名華麗景天、長(zhǎng)藥八寶、大葉景天、八寶、活血三七、對(duì)葉景天、白花蝎子草等，為景天科八寶屬多年生常用多肉植物。花小，密集，鮮艷，花期長(zhǎng)，整株植物綠色期長(zhǎng)，是集觀葉、觀莖、觀花為一體的優(yōu)良宿根花卉?？购浴⒛秃敌院瓦m應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，室內(nèi)外均可栽培[1]。景天科植物白粉病病原有Erysiphesedi、E.umbilici(又名Microsphaeraumbilici)、Golovinomycesorontii(又名E.orontii)、Podosphaeraxanthii以及Oidiumsub.Pseudoidium[2-5]。劉鐵志[6]報(bào)道了內(nèi)蒙古景天科植物白八寶(Hylotelephiumpallescens)和費(fèi)菜(Sedumaizoon)白粉病的病原為Erysiphesedi。趙震宇等[7]在新疆大葉紅景天上發(fā)現(xiàn)有景天叉絲殼(Microsphaerasedi)的危害。2018年夏天，在石河子明珠河公園內(nèi)，長(zhǎng)藥八寶白粉病嚴(yán)重發(fā)生，白色粉狀物布滿植株的葉片、葉柄和莖桿，在葉片上形成灰白色的壞死斑，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)植株葉片脫落，影響花卉的觀賞價(jià)值，但新疆關(guān)于長(zhǎng)藥八寶白粉病的研究鮮見報(bào)道。筆者通過病原菌生物學(xué)形態(tài)鑒定和ITS 序列分析明確了該病原菌分類地位，旨在為病害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料長(zhǎng)藥八寶白粉病標(biāo)本于2018年6—9月采自新疆石河子市區(qū)明珠河公園內(nèi)，采集田間表現(xiàn)明顯白粉病癥狀的樣本帶回室內(nèi)進(jìn)行鑒定。

1.2田間癥狀觀察在田間病害癥狀明顯時(shí)，觀察病害在田間的癥狀表現(xiàn)，包括發(fā)病部位、病斑的顏色、大小、病株的生長(zhǎng)狀況以及閉囊殼的產(chǎn)生等。

1.3病菌形態(tài)學(xué)鑒定將采集的新鮮病樣帶回室內(nèi)采用膠帶粘帖法觀察和測(cè)量病菌無性時(shí)代的特征；包括菌絲體的形態(tài)、分生孢子梗的形狀、長(zhǎng)度，分生孢子的著生方式、形態(tài)特征和孢子萌發(fā)。待病株上產(chǎn)生黑色小點(diǎn)的閉囊殼后，用解剖針挑取閉囊殼，顯微觀察并測(cè)量閉囊殼的形狀、大小，附屬絲的形態(tài)、數(shù)量、長(zhǎng)度，閉囊殼內(nèi)子囊的數(shù)量、形態(tài)、大小以及子囊內(nèi)子囊孢子的數(shù)量、形態(tài)、大小等[6-7]。依據(jù)觀察和測(cè)定結(jié)果，參照白粉病菌鑒定特征[8-11]，確定引起新疆長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原。

1.4病菌rDNA-ITS區(qū)序列的擴(kuò)增和分析

1.4.1病菌基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)展。將發(fā)病的新鮮葉片采集后帶回室內(nèi)，用干凈的毛筆刷取收集葉片上的白粉，用BioFlux公司真菌基因組DNA提取試劑盒，提取收集的病菌基因組DNA。用真核生物核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS區(qū))通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')[12]進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，電泳觀察目標(biāo)片段的大小。

1.4.2病菌rDNA-ITS區(qū)序列的分析。 將PCR擴(kuò)增后的目標(biāo)片段送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后的結(jié)果在NCBI 的 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST序列同源性分析，同時(shí)通過查閱資料，下載已報(bào)道的能引起八寶屬(Hylotelephium)和景天屬(Sedum)以及當(dāng)?shù)鼗ɑ苤参锇追鄄〉牟≡璉TS區(qū)序列，以引起景天紫斑病的病原(Cercosporapseudokalanchoes)作為外圍序列。采用MEGA6.0軟件鄰近距離法(Neighborhood-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1病害癥狀長(zhǎng)藥八寶白粉病在石河子從6月初開始在植株下部葉片上出現(xiàn)零星白色的小霉斑，6—7月病害迅速擴(kuò)展，向上部葉片及周圍的植株大量擴(kuò)散，7月中下旬至8月病害達(dá)到高峰期，造成整株植物發(fā)病，下部葉片干枯脫落成光桿。病菌主要侵染葉片、上部幼嫩的莖桿和花器，花瓣一般無明顯癥狀。發(fā)病初期，植株下部葉片正面形成白色放射狀的白色霉斑，霉斑覆蓋處的葉肉組織變成灰色或灰褐色，但葉肉不壞死，嚴(yán)重時(shí)從葉緣處焦枯，隨之葉片自下而上干枯死亡，形成光桿，嚴(yán)重影響植株的生長(zhǎng)及觀賞價(jià)值(圖1A)。莖桿感染多發(fā)生在中上部幼嫩組織，在莖桿上形成白色不規(guī)則形的霉斑，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)上部莖桿均呈白色(圖1B)。病菌還能侵染長(zhǎng)藥八寶的整個(gè)花序，包括花梗、花蕾和托葉等，感染嚴(yán)重的整個(gè)花序被白粉遮蓋，造成整個(gè)花蕾提早脫落不能正常開花或提前凋謝(圖1C)，縮短花期或花朵的觀賞品質(zhì)；在石河子，病斑上從8月中旬開始先在葉片背面形成少量分散的初為黃色后為黑色的小粒點(diǎn)，即病菌的閉囊殼，從9月中旬開始，葉片、莖桿和花器上出現(xiàn)大量散生的黑色小點(diǎn)——閉囊殼，且整個(gè)植株幾乎被病菌所覆蓋(圖1D)。

圖1 病害田間癥狀Fig.1 Symptoms of powdery mildew on Hylotelephium spectabile

2.2病原的形態(tài)特征通過顯微觀察，長(zhǎng)藥八寶白粉病的菌絲體無色透明，直徑為4.7 μm(2.9～6.1 μm)；菌絲的附著胞成裂瓣?duì)睿瑔紊驅(qū)ι?圖2A、B)；分生孢子梗直或稍彎曲，2～3個(gè)細(xì)胞組成，長(zhǎng)度為55.9(51.2～61.0)μm×5.6(3.8～7.5)μm，上單生1個(gè)分生孢子(圖2C)；分生孢子單胞、透明、橢圓形到圓形，無纖維狀體，大小39.3(29.3～45.1)μm×18.8(14.6～22.0)μm(圖2D)，芽管從孢子一端萌發(fā)。

病菌的閉囊殼初期散生在葉片的背面，后期散生或聚生在植株所有感染部位，閉囊殼球形或扁球形，直徑117.0(62.9～168.5)μm，褐色到黑色，壁細(xì)胞不規(guī)則多邊形；閉囊殼上著生5～21根菌絲狀附屬絲，直或彎曲，常屈膝狀，基部褐色，頂部無色，長(zhǎng)度為子囊果直徑的0.5～1.0倍(圖2E)，0～8個(gè)分隔；閉囊殼有2～7個(gè)圓形到卵圓形的子囊(圖2F)，子囊無色，有短柄或無柄，大小為60.1(46～72.3)μm×48.1(35.4～65.5)μm；子囊內(nèi)大多2～4個(gè)子囊孢子(圖2G)。根據(jù)病原的形態(tài)特征，參考《新疆白粉菌、銹菌和黑粉菌圖鑒》[7]《中國真菌志》[5]以及其他相關(guān)白粉病鑒定資料[6]，其與已報(bào)道的Erysiphesedi的特征基本一致，故將引起新疆石河子市區(qū)長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原初步確定為Erysiphesedi。

2.3rDNA-ITS區(qū)序列的測(cè)定與分析對(duì)長(zhǎng)藥八寶白粉病菌(菌株號(hào) SHZUsed1)rDNA-ITS區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了639 bp的DNA片段，將測(cè)序后的結(jié)果在NCBI 的 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與已報(bào)道的景天白粉菌Erysiphesedi(登錄號(hào)：JX173289，JX173290，KR091961，KX580800)和Pseudoidiumhortensiae(MG654731)序列相似性高達(dá)99.8%以上，與報(bào)道的引起景天科植物白粉病的其他種以及石河子地區(qū)花卉上常見白粉病的病原序列相似性較低(圖3)。由此可以推斷，引起新疆石河子市區(qū)長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原為景天白粉菌Erysiphesedi。

3 結(jié)論與討論

據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，引起景天科植物白粉病的病原主要有以下幾種：Erysiphesedi、E.umbilici(又名Microsphaeraumbilici)、Golovinomycesorontii(又名E.orontii)、Podosphaeraxanthii、Microsphaerasedi以及Oidiumsub.Pseudoidium，但不同種之間在形態(tài)特征上存在明顯差異，E.umbilici和M.sedi其閉囊殼上的附屬絲都不是菌絲狀，而是二叉或三叉式分支；G.orontii無性時(shí)代分生孢子的著生方式為串生，而非單生；P.xanthii閉囊殼內(nèi)只有1個(gè)子囊；該研究觀察到的病菌形態(tài)特征與已報(bào)道的景天白粉病菌E.sedi幾乎完全一致；且病菌ITS區(qū)序列的比對(duì)結(jié)果也顯示出二者之間具有極高的同源性(大于99.8%)，因此，通過病害癥狀表現(xiàn)、病菌形態(tài)特征的觀察以及ITS區(qū)序列的比對(duì)和分析，將引起新疆長(zhǎng)藥八寶白粉病的病原確定為景天白粉病菌Erysiphesedi，這是該病原在新疆的首次報(bào)道。

注：A、B.菌絲及附著胞；分生孢子梗；C、D.分生孢子梗和分生孢子；E.閉囊殼和附屬絲；F.閉囊殼內(nèi)有多個(gè)子囊；G.子囊和子囊孢子Note:A,B. Hyphal appressoria; C,D. Conidiophores and Conidia; E. Chasmothecia and appressoria; F.Chasmothecia containing several asci;G. Asci and ascospores圖2 長(zhǎng)藥八寶白粉病菌的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of powdery mildew on Hylotelephium spectabile

圖3 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的病原菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on rDNA ITS sequences Erysiphe.spp

景天白粉病菌(E.sedi)除可以感染景天屬和八寶屬的花卉外，還可以感染景天科其他屬的植物，包括伽藍(lán)菜(Kalanchoeblossfeldiana)[14-15]、落地生根(Bryophyllumpinnatum)[16]和日本瓦松(Orostachysjaponica)[17]等。關(guān)于病原菌傳入新疆的主要途徑可能與引種過程中的種苗攜帶有密切的關(guān)系，目前在建設(shè)園林城市的過程中，大量從國內(nèi)外引入性狀優(yōu)良的花卉在本地栽培，為病害的傳播和擴(kuò)散創(chuàng)造了有利條件，因此，必須嚴(yán)格進(jìn)行檢疫和種苗處理，以保證花卉在本地的栽植和觀賞。另外病害在不同地區(qū)及不同寄主上的發(fā)病規(guī)律也少有報(bào)道，今后需對(duì)病害的發(fā)生規(guī)律及防治措施進(jìn)行深入研究，以便為有效控制病害的擴(kuò)展和蔓延，保持其更好的觀賞價(jià)值奠定基礎(chǔ)。