氨氮脅迫對凡納濱對蝦的生長狀況及蝦肝腸胞蟲(EHP)攜帶量的影響

徐勝威，楊 程，斯烈鋼，申屠基康，沈偉良

(寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315000)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對蝦，隸屬甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)對蝦科(Penaeidae)對蝦屬(Penaeus)，主要分布于太平洋海岸水域[1]。由于其肌肉成分中脂肪含量低，蛋白含量高，并富含多種飽和脂肪酸，使其具有較高的營養(yǎng)價值。凡納濱對蝦因其生長周期短，抗逆性強，經(jīng)濟效益高，成為全球養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大優(yōu)良品種之一，并于20世紀80年代末引入我國，經(jīng)過30多年的發(fā)展，其養(yǎng)殖面積不斷擴大，技術(shù)不斷更新，目前已成為我國水產(chǎn)品養(yǎng)殖面積最大的品種之一[2]。然而，由于凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量高，經(jīng)濟效益顯著，集約化養(yǎng)殖模式發(fā)展迅速，養(yǎng)殖密度逐漸提高，導(dǎo)致養(yǎng)殖環(huán)境的不斷惡化，養(yǎng)殖水體污染嚴重，其中氨氮作為重要的水質(zhì)因子已成為影響水產(chǎn)養(yǎng)殖品種健康生長的主要因素之一。研究表明，在一定濃度的氨氮脅迫下水產(chǎn)病害極易發(fā)生和流行[3]。蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)屬于真菌界(Fungi)微孢子蟲門(Microsporidia)單倍期綱(Haplophasea)壺孢目(Chytridiopsida)腸胞蟲科(Enterocytozoonidae)腸胞蟲屬(Enterocytozoon)[4-5]，屬于細胞內(nèi)寄生[6-7]，是目前影響對蝦養(yǎng)殖的主要疾病之一，最早于2009年在泰國發(fā)現(xiàn)，2013年我國第一次在養(yǎng)殖凡納濱對蝦中檢測出EHP，并有很高的感染率[8]。運用PCR檢測技術(shù)可以從感染EHP的凡納濱對蝦的水環(huán)境、排泄物及肝胰腺等器官中檢測出EHP[9-11]，其鰓、血淋巴、腸、心臟、肌肉組織也均可檢測到EHP[12-13]，但不同組織中EHP的含量差異及它們間的相互關(guān)系還不明確。感染后的對蝦仍可以繼續(xù)存活和進食，但會出現(xiàn)生長緩慢甚至停止生長現(xiàn)象，需要得到足夠重視，否則病原的大規(guī)模擴散會導(dǎo)致養(yǎng)殖戶浪費過多的飼料，造成嚴重的經(jīng)濟損失[14-16]。

由于EHP的特殊存在方式，目前還沒有明確的治療藥物，所以在養(yǎng)殖過程中注意容易感染的環(huán)節(jié)，通過改善水體，輔助一些維生素、中草藥成分，可以起到一定的預(yù)防效果[17]。目前關(guān)于研究主要集中在氨氮對對蝦的急性毒性方面的研究[18-19]，關(guān)于EHP對對蝦的的生長狀況的研究較少[20-21]，而關(guān)于氨氮與EHP之間的關(guān)系研究鮮見報道。筆者研究了不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦體長和體重的影響，利用實時定量PCR技術(shù)分析氨氮脅迫對其EHP攜帶量的影響，以期為對蝦養(yǎng)殖業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物。試驗用蝦取自寧波市海洋與漁業(yè)科技創(chuàng)新基地，選取肢體完整、體格相近的凡納濱對蝦為試驗蝦，體長(4.0±0.5) cm，體重(0.38±0.02)g。試驗開始前，將凡納濱對蝦撈出分別放入9個試驗容器(600 L圓桶，300尾/桶)中暫養(yǎng)7 d，每天投喂4次(06：00、11：00、16：00、21：00)，餌料適量(以2 h內(nèi)吃凈為準)。隨著凡納濱對蝦的生長，飼料由0號料變?yōu)?號料，餌料量隨之增加，投食改為每天3次(06：00、13：00、20：00)，每2 d換水1次，換水量為總體積的10%。

1.1.2試劑。DNA提取試劑盒(Tissue DNA Kit)購自O(shè)mega公司；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國)；氯化銨為分析純試劑(上海生工)。

1.1.3試驗用水。用經(jīng)沙過濾處理的海水作為試驗用水，鹽度(24±1)‰，水溫(25±1)℃，pH為(8.0±0.2)，氨氮濃度為0.1 mg/ L，亞硝酸氮濃度為0.003 mg/ L，溶解氧含量為(6.5±0.5)mg/ L，水質(zhì)符合 NY 5052—2001無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標準(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部2001)的要求；在試驗用基礎(chǔ)水中添加適量的NH4Cl母液，調(diào)配成不同濃度的NH4Cl試驗水。

1.2方法參考大量文獻并經(jīng)過預(yù)試驗，設(shè)置0.1 mg/L(空白組)、6.0 mg/L(試驗組Ⅰ)、9.0 mg/L(試驗組Ⅱ)3個氨氮濃度組，每組3個平行，每個平行投放試驗對蝦300尾，試驗期為30 d，試驗期間每天投料4次，每天監(jiān)測養(yǎng)殖水體氨氮濃度，并用NH4Cl母液穩(wěn)定試驗所需的氨氮濃度。

1.2.1對蝦體長和體重的測定。將試驗對蝦投放試驗容器前，隨機選取100尾對蝦進行體長和體重的測定，并統(tǒng)計大蝦(體長>4.5 cm)、中蝦(體長4.0～4.5 cm)及小蝦(體長<4.0 cm)所占的比例，再取肝胰腺置于無水乙醇中-80 ℃下保存，備用；然后，每隔10 d從每個平行組中隨機取30尾凡納濱對蝦進行體長和體重的測定，并取肝胰腺置于無水乙醇中-80 ℃下保存，備用；每次采樣結(jié)束后，記錄每個組存活的蝦數(shù)目，計算不同氨氮濃度下凡納濱對蝦的EHP感染率和存活率；第4次采樣后，每組隨機取100尾蝦測量體長，并統(tǒng)計大蝦、中蝦及小蝦所占的比例。

1.2.2實時定量PCR檢測凡納濱對蝦的EHP攜帶量。

1.2.2.1標準曲線的繪制。取感染EHP的凡納濱對蝦肝胰腺提取的總DNA為模板，用定量用特異引物(引物EHP-F為5′-GACCAACGGAGGCGAAAGCG-3′，EHP-R為5′-CAACGGCCATGCACCACTCTT-3′)進行PCR擴增，將得到的目的片段連接、轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒，使用核酸蛋白測定儀(NanoDrop ND-2000，Thermo)測定所提質(zhì)粒的濃度，將所測濃度的質(zhì)粒按10倍梯度稀釋成13管，并采用實時定量PCR，以含有EHP基因片段的質(zhì)粒濃度梯度所對應(yīng)的CT值為縱坐標，以質(zhì)粒濃度的稀釋倍數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2實時定量PCR。采用三步法在ABI 7500上進行實時定量PCR，具體操作參照FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，德國)試劑盒說明書。反應(yīng)體系(20 μL)如下：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、10 μmol/L EHP-F 1 μL、10 μmol/L EHP-R 1 μL、模板1 μL、ddH2O 7 μL。

將不同樣品中EHP基因的表達量所對應(yīng)的CT值與標準曲線相對照，即可得到該樣品目的基因表達量的相對濃度值，最后根據(jù)含目的基因的質(zhì)粒分子量，計算出樣品的拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1EHP的標準曲線將含有EHP的質(zhì)粒原液經(jīng)10倍梯度稀釋后作為模板，進行熒光定量檢測。以含有EHP基因片段的質(zhì)粒濃度梯度所對應(yīng)的CT值為縱坐標，以質(zhì)粒濃度的稀釋倍數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。從圖1可以看出，線性回歸方程R2為0.998 2，線性較好，且經(jīng)預(yù)試驗確定樣品濃度在曲線區(qū)間內(nèi)。

2.2不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦存活率和感染率的影響由圖2可知，0～10 d各組EHP感染率上升幅度較大，10～30 d趨于平穩(wěn)；空白組先于試驗組達到100%感染率，氨氮濃度越低，EHP感染率越早達到峰值，表明氨氮對EHP影響有一定的時間-劑量效應(yīng)。

圖1 EHP的標準曲線Fig.1 Standard curve of EHP

圖2 氨氮腔迫對凡納濱對蝦EHP感染率的影響Fig.2 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP infection rate of L.vannamei

由圖3可知，試驗結(jié)束時，各組凡納濱對蝦的存活率從大到小依次為試驗組Ⅱ、空白組、試驗組Ⅰ，表明試驗組Ⅱ凡納濱對蝦的健康狀況優(yōu)于試驗組Ⅰ和空白組。

圖3 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦存活率的影響Fig.3 Effects of ammonia nitrogen stress on survival rate of L.vannamei infected with EHP

2.3不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦體長和體重的影響從圖4可以看出，各組凡納濱對蝦的體長變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢，表明9.0 mg/L氨氮對感染EHP凡納濱對蝦的體長增長有一定的促進作用。

從圖5可以看出，各組凡納濱對蝦的體重變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢，表明9.0 mg/L氨氮對感染EHP凡納濱對蝦的體重增長有一定的促進作用。

圖4 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體長的影響Fig.4 Effects of ammonia nitrogen stress on body length of L.vannamei infected with EHP

圖5 氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體重的影響Fig.5 Effects of ammonia nitrogen stress on body weight of L.vannamei infected with EHP

由表1可知，試驗結(jié)束后，空白組大蝦增長率為9.17%，試驗組Ⅰ的大蝦增長率為19.29%，試驗組Ⅱ的大蝦增長率最高(22.65%)，且小蝦所占的比例下降明顯。

表1 0 d和30 d各組不同大小凡納濱對蝦所占比例

2.4不同濃度氨氮脅迫對凡納濱對蝦EHP攜帶量的影響從圖6可以看出，各組EHP攜帶量的變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)單調(diào)遞增的趨勢，0～10 d 3組EHP攜帶量差異不大，10～30 d空白組EHP攜帶量最高，表明試驗組Ⅱ抑制EHP表達的效果優(yōu)于空白組和試驗組Ⅰ。

3 討論

在養(yǎng)殖水體中，氨氮作為重要的水質(zhì)因子之一，主要以NH3和NH4+2種形式存在，其中NH3對水生動物的損傷最嚴重，NH3不帶電荷可以穿透水生動物體表進入體內(nèi)，破壞水生動物的生理機能，能夠?qū)ζ浣M織器官造成損傷，引發(fā)甲殼動物急性中毒癥狀，對水生動物的健康生長有著重要的影響[22-25]。肝胰腺作為重要的新陳代謝和解毒器官，是對蝦在氨氮脅迫下表現(xiàn)最敏感的器官[26]。研究表明，氨氮脅迫會降低蝦類的免疫力，增加對病原體的感染率[27-28]。

圖6 氨氮脅迫對凡納濱對蝦EHP攜帶量的影響Fig.6 Effects of ammonia nitrogen stress on EHP carrying capacity of L.vannamei

EHP作為對蝦養(yǎng)殖中重要的病原之一，主要侵染對蝦的肝胰腺和腸道，能夠從宿主細胞獲得能量，影響對蝦的生長發(fā)育。該試驗研究了不同濃度氨氮脅迫對感染EHP凡納濱對蝦體重和體長的影響，結(jié)果表明試驗組Ⅱ凡納濱對蝦體重和體長的增長情況優(yōu)于試驗組Ⅰ和空白組，而試驗組Ⅱ凡納濱對蝦的EHP攜帶量最少。研究表明，EHP的攜帶量與對蝦的體重和體長等指標有一定的相關(guān)性，呈現(xiàn)負相關(guān)性[29-30]；氨氮脅迫影響蝦類的生長發(fā)育，而肝胰腺是受到損害最主要的器官[31]，與EHP侵染的是同一器官。由于EHP進化過程中沒有合成ATP 的功能[32]，所以其生長繁殖和能量代謝只能利用宿主細胞的ATP，從而影響宿主的能量代謝[33]。氨氮損傷肝胰腺引起其合成ATP功能減弱，EHP在肝胰腺細胞中得不到足夠的能量，從而抑制自身的生長甚至死亡，導(dǎo)致凡納濱對蝦EHP攜帶量減少，延緩EHP的感染率以及提高對蝦的存活率。該試驗結(jié)果表明當氨氮濃度為9.0 mg/L時，凡納濱對蝦的生長狀況優(yōu)于其他2組，EHP攜帶量少于其他2組，個體較大的凡納濱對蝦 EHP 攜帶量明顯低于較小的個體[33]，EHP感染率及存活率也低于其他2組，空白組和試驗組Ⅰ除了存活率有明顯差異外，其他指標均無明顯差異。這說明氨氮在一定濃度范圍內(nèi)可以有效控制EHP的攜帶量，即當養(yǎng)殖水體氨氮濃度為6.0～9.0 mg/L時，可以有效減少凡納濱對蝦EHP 的攜帶量，從而為對凡納濱對蝦的養(yǎng)殖提供重要的指導(dǎo)意義。