西北高海拔地區(qū)放養(yǎng)偶蹄類動(dòng)物腸道微生物多樣性的宏基因組比較研究

尚立強(qiáng)，薛世魁，王惜婧，張小麗*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省蘭州市城關(guān)區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅蘭州 730030)

宏基因組學(xué)(metagenomics)是一種以新一代高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，以特定環(huán)境下微生物群體基因組為研究對(duì)象，分析微生物群體的多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及其與環(huán)境的關(guān)系，發(fā)掘潛在的生物學(xué)意義。與傳統(tǒng)微生物研究方法相比，宏基因組測(cè)序技術(shù)規(guī)避了絕大部分微生物不能培養(yǎng)、痕量菌無法檢測(cè)的缺點(diǎn)，可從基因?qū)用鎸?duì)整個(gè)微生物群落進(jìn)行分析，并可使序列結(jié)果分析的速度與準(zhǔn)確性都大大提高[1]。目前，該技術(shù)已被成功應(yīng)用于研究污水、植物、動(dòng)物及人體等多種環(huán)境中微生物的多樣性[2-5]。通過宏基因組測(cè)序分析技術(shù)不僅可以明確宿主與微生物之間的相互關(guān)系，提高宿主的健康狀態(tài)和營養(yǎng)水平，而且可以增加對(duì)宿主胃腸道微生物代謝通路的了解。近年來，關(guān)于動(dòng)物腸道微生態(tài)的研究受到人們廣泛關(guān)注，研究動(dòng)物腸道微生物不僅可以描述動(dòng)物腸道微生物的系統(tǒng)發(fā)育，分析其腸道菌群功能，了解其胃腸道微生物區(qū)系的變化規(guī)律、信號(hào)通路及其響應(yīng)機(jī)制，而且可以通過改變腸道微生物組成、增加優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量等有效措施預(yù)防和治療某些腸道疾病，進(jìn)而為動(dòng)物健康、可持續(xù)的繁殖和生存做出貢獻(xiàn)，同時(shí)也為研究動(dòng)物生存環(huán)境的微生物多樣性提供了相關(guān)數(shù)據(jù)[6-7]。

武威市地處我國西北地區(qū)，位于101°49′～104°16′E，36°29′～39°27′N，擁有南部祁連山山地、中部走廊平原和北部荒漠3個(gè)地貌單元，海拔介于1 020～4 874 m。雙峰駱駝、綿羊及白牦牛是這一地區(qū)主要放養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。其中，天祝白牦牛是我國稀有而珍貴的地方牦牛類群，是經(jīng)過長期自然選育和人工選育而成的特有畜種，已被列入國家級(jí)畜禽保護(hù)品種，其腸道微生物的多樣性具有很強(qiáng)的地域代表性。通過研究這些動(dòng)物腸道微生物的多樣性，可為進(jìn)一步了解我國西北高海拔地區(qū)特有的環(huán)境微生物多樣性提供參考依據(jù)。筆者采集了這3種動(dòng)物的糞便樣品并提取其總DNA，通過宏基因組denovo測(cè)序和生物信息學(xué)分析，闡明并比較了這些動(dòng)物腸道微生物的多樣性，并對(duì)其群落功能進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器瓊脂糖、PBS、抗生素、TaqMaster Mix、DNA Marker 2000，均購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司；NanoDrop2000購自Thermo Scientific公司。

1.2糞便樣品采集從甘肅省武威市采集新鮮的雙峰駱駝、綿羊及白牦牛糞便樣品各15份。樣品采集時(shí)避開外部雜菌污染區(qū)對(duì)中部的糞便樣品進(jìn)行無菌采集后儲(chǔ)存于冰盒中，立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.3DNA提取及檢測(cè)利用QIAamp DNA Stool Mini Kit對(duì)樣品總DNA進(jìn)行提取，所有操作按照試劑盒提供的操作說明書進(jìn)行。DNA提取完畢后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)抽提的基因組DNA完整性進(jìn)行了檢測(cè)。同時(shí)，利用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)和TBS-380微型熒光計(jì)(Promega，USA)對(duì)抽提DNA樣品的純度和濃度分別進(jìn)行了測(cè)定。條帶單一或稍有彌散，無色素、RNA、蛋白等雜質(zhì)污染，總量滿足2次建庫需求的DNA樣品方可進(jìn)行后續(xù)測(cè)序分析。

1.4上機(jī)文庫構(gòu)建及測(cè)序檢測(cè)合格的DNA樣品由美吉生物公司進(jìn)行文庫構(gòu)建及測(cè)序。利用Covaris M220超聲發(fā)生器將合格的DNA樣品打斷成300 bp左右的片段，然后使用TruSeq Nano DNA Sample Preparation Kits選擇性回收目的片段并在兩端連接接頭，以構(gòu)建測(cè)序文庫。文庫建好后，使用Illumina Hiseq2500平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序，測(cè)序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(也稱為原始數(shù)據(jù)RawData)用于后續(xù)的生物信息分析。

1.5序列處理及生物信息學(xué)分析為了提高后續(xù)分析質(zhì)量和可靠性，首先對(duì)原始序列進(jìn)行了拆分、質(zhì)量剪切以及去除污染等優(yōu)化處理。使用軟件Seqprep(https：//github.com/jstjohn/SeqPrep)去除含N堿基的reads，對(duì)序列3’端和5’端進(jìn)行質(zhì)量剪切，然后使用軟件Sickle(https：//github.com/najoshi/sickle)去除剪切后長度小于50 bp及平均質(zhì)量值低于20的reads，保留高質(zhì)量的pair-end reads和single-end reads，最后通過BWA軟件(http：//bio-bwa.sourceforge.net)將reads比對(duì)宿主DNA序列，去除與宿主基因組相似性高的污染reads。將優(yōu)化處理后的序列使用拼接軟件SOAPdenovo(http：//soap.genomics.org.cn/，Version 1.06)進(jìn)行拼接組裝。拼接主要參數(shù)k-mer值設(shè)范圍為39～47。在scaffolds內(nèi)部gap處，將scaffolds打斷成新的contigs，并對(duì)大于等于500 bp的contigs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從中選擇最優(yōu)組裝結(jié)果。使用MetaGene(http：//metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)對(duì)拼接結(jié)果中的contig進(jìn)行基因預(yù)測(cè)。

然后，對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行物種相對(duì)豐度和功能上的分類及注釋。使用BLASTP程序(BLAST Version 2.2.28+，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將基因集序列分別與eggNOG數(shù)據(jù)庫(http：//eggnog.embl.de/)和KEGG 數(shù)據(jù)庫( http：//www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行比對(duì)(e值為1e-5)，進(jìn)而獲得詳細(xì)的物種注釋。此外，在上述分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了相似聚類，分組排序、差異比較等多方向的統(tǒng)計(jì)分析和探索，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了可視化展示，挖掘數(shù)據(jù)中的有效信息。

2 結(jié)果與分析

2.1門水平上不同動(dòng)物腸道微生物的比較該研究對(duì)雙峰駱駝、綿羊和白牦牛的糞便樣品進(jìn)行了宏基因組學(xué)分析，每個(gè)樣本平均產(chǎn)生15 Gbp的測(cè)序數(shù)據(jù)。分類學(xué)分析結(jié)果顯示，在門水平上雙峰駱駝、綿羊和白牦牛的腸道微生物群落主要分布于以下7個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(占比大于1%)，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和廣古菌門(Euryarchaeota)。其中Bacteroidetes在3種動(dòng)物腸道中相對(duì)豐度都是最高的(駱駝64.61%，綿羊63.95%，白牦牛77.09%)，其次是Firmicutes(駱駝21.53%，綿羊7.54%，白牦牛12.48%)。這表明草食動(dòng)物在腸道微生物多樣性上存在一致性。其余5個(gè)優(yōu)勢(shì)門類在3種動(dòng)物中的相對(duì)豐度各不相同(圖1a)。Fibrobacteres在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為3.41%、7.54%和0.08%；Proteobacteria在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為2.48%、4.71%和4.15%；Spirochaetes在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為0.68%、5.03%和0.68%；Verrucomicrobia在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為1.96%、1.41%和2.41%；Euryarchaeota在駱駝、綿羊和白牦牛中的占比分別為0.15%、1.60%和1.60%。

圖1 門(a)和屬(b)水平上不同動(dòng)物腸道微生物的比較 Fig.1 Comparison of intestinal microbe among different animals at phylum(a) and genus(b) levels

2.2屬水平上不同動(dòng)物腸道微生物的比較在屬水平上，3種動(dòng)物的腸道微生物群落主要分布于以下4個(gè)優(yōu)勢(shì)屬(占比大于10%)，包括擬桿菌屬(Bacaeroides)、Alistipes、普氏菌屬(Prevotella)和 纖維桿菌屬(Fibrobacter)，其中Bacteroides在3種動(dòng)物腸道中的相對(duì)豐度都是最高的(駱駝28.09%，綿羊22.62，白牦牛31.43%)(圖1b)。利用韋恩圖展示3種動(dòng)物各自特有和共有細(xì)菌物種數(shù)目，結(jié)果顯示這3種動(dòng)物的腸道微生物種類在分類學(xué)水平屬上存在高度的相似性(圖2)。駱駝、綿羊和白牦牛腸道中所鑒定到的總的屬數(shù)目分別為1 393、1 223和1 404個(gè)，而其中3種動(dòng)物所共有的屬數(shù)目多達(dá)1 067個(gè)，說明這一地區(qū)的環(huán)境微生物群落具有一定的穩(wěn)定性。

2.3COG功能分析為了調(diào)查3種不同動(dòng)物之間的腸道微生物基因功能差異，將基因集序列與eggNOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)(e值為1e-5)獲得基因?qū)?yīng)的COG(Clusters of orthologous groupsof proteins)，然后使用COG對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該COG的豐度。結(jié)果顯示，3種動(dòng)物都有20個(gè) functional COG categories 被檢測(cè)到，而且它們之間的豐度存在高度的相似性(圖3)。

圖2 不同動(dòng)物腸道微生物種類的比較 Fig.2 Comparison of intestinal microbe populations in different animals

3種基因組中存在大量的高質(zhì)量序列并未匹配到以上任何屬中，這些序列沒有與任何生物類群匹配，意味著這些序列與當(dāng)前生物信息數(shù)據(jù)庫中任何已知生物的序列沒有相關(guān)性或者這些序列與它們的親緣關(guān)系非常遠(yuǎn)。因此，這3種動(dòng)物腸道中蘊(yùn)藏著驚人的生物多樣性。

為進(jìn)一步了解不同動(dòng)物之間的差異，根據(jù)COG之間的相似度關(guān)系，得到聚類后的菌群相對(duì)豐度比較熱圖。從圖4可以看出，3種動(dòng)物間COG具有較高的相似性。

2.4KEGG功能注釋利用BLAST將基因集序列與KEGG 的基因數(shù)據(jù)庫(GENES)進(jìn)行比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果使用KOBAS 2.0軟件進(jìn)行功能注釋。使用KO、Pathway、EC、Module 對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該功能類別的豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，駱駝、綿羊及白牦牛這3種動(dòng)物腸道菌群可能參與的代謝通路分別為311、199及305個(gè)，涉及到各個(gè)方面，包括脂肪酸的代謝、多糖的代謝、蛋白酶以及肽酶的產(chǎn)生等。同時(shí)，3種動(dòng)物共同所涉及的代謝通路有188條，因此3種動(dòng)物腸道菌群所涉及的功能具有較高的相似性。

圖3 不同動(dòng)物腸道微生物種類的比較Fig.3 Comparison of intestinal microbe species in different animals

圖4 不同動(dòng)物腸道段及糞便腸道微生物屬比較熱圖Fig.4 Heatmap analysis of COGs of genes in the intestinal segments and fecal intestinal microflora of different animals

3 討論

已有的動(dòng)物腸道微生物研究顯示不同動(dòng)物之間在腸道微生物多樣性方面有明顯差異。此外，環(huán)境在很大程度上影響動(dòng)物腸道微生物多樣性[8]。該研究結(jié)果也表明，駱駝、綿羊及白牦牛這3種動(dòng)物腸道菌群是不同的，但由于其生存環(huán)境的一致性導(dǎo)致其腸道段微生物的種類和分布具有高度的相似性，這與以前的研究報(bào)道相一致。

不同動(dòng)物的腸道段微生物的種類和分布特點(diǎn)和規(guī)律不同，在門水平上，擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)、螺旋體門(Spirochaetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和廣古菌門(Euryarchaeota)等菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，而在在屬水平上擬桿菌屬(Bacaeroides)、Alistipes、普氏菌屬(Prevotella)和 纖維桿菌屬(Fibrobacter)等菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，具有明顯的差異。此外，差異微生物所富集的代謝通路在不同動(dòng)物中是不同的，主要差異在物質(zhì)代謝和傳染性疾病相關(guān)通路，但仍具有高度的相似性。

我國西部高海拔地區(qū)物種分布廣泛、種類眾多，該研究結(jié)果可為了解我國西部高海拔地區(qū)的微生物多樣性，特別是我國所特有的白牦牛等動(dòng)物的腸道微生物多樣性提供重要信息。