HBV研究模型新進(jìn)展

畢延偉，楊小強(qiáng)，#，孫平楠，周小玲，*

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞P2實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 汕頭 515041；3. 廣東省感染病與分子免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是噬肝病毒屬小包膜DNA病毒。乙型肝炎嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，全球約有3.5億乙肝病毒慢性攜帶者，每年約68.6萬(wàn)人死于乙肝病毒慢性感染[1]。中國(guó)是乙型肝炎大國(guó)，慢性乙肝病毒感染者面臨較大的肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[2]。現(xiàn)階段治療乙型肝炎的藥物主要有兩類(lèi)：干擾素(如干擾素α/β等)和類(lèi)核苷酸類(lèi)藥物(如拉米夫定、恩替卡韋等)。此外，HBV新藥——多肽類(lèi)藥物 Myrcludex B[MyrB，HBV功能性受體鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)的抑制劑]正處于II期臨床實(shí)驗(yàn)階段[3]。2012年，李文輝課題組證實(shí)NTCP作為功能性受體可以介導(dǎo)HBV及丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)進(jìn)入肝細(xì)胞，為HBV相關(guān)研究開(kāi)啟了一扇嶄新的大門(mén)。近年來(lái)干細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，也有力的推動(dòng)了HBV研究模型的發(fā)展。本文分別從病毒來(lái)源、細(xì)胞和動(dòng)物感染模型等方面對(duì)HBV研究模型領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 感染用HBV的來(lái)源

1.1 患者血清來(lái)源的HBV

天然來(lái)源的HBV存在于乙肝患者血液中，HBV表面抗原(HBsAg)、E抗原(HBeAg)和核酸(HBV DNA)均可在其中檢測(cè)到。由于HBV在人體中復(fù)制速度快且感染能力強(qiáng)，因此血清中HBV DNA的拷貝數(shù)達(dá)到很高水平。乙肝患者血清來(lái)源的HBV可反映肝臟HBV感染情況、患者體內(nèi)HBV的血清型和基因型、肝組織中HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)和HBV DNA之間的關(guān)系。早期分類(lèi)系統(tǒng)基于表面抗原(HBsAg)的抗原特性將HBV分為ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw3、adw4q-、adrq-和 adrq+等 10 種不同的血清亞型。其依據(jù)是：決定簇d/y和w/r的分子基礎(chǔ)是表面抗原(HBsAg)第122和160號(hào)氨基酸殘基的K/R轉(zhuǎn)換，以及其他氨基酸位置決定w1～w4和q的反應(yīng)性[4]?，F(xiàn)已知的HBV基因型有A～J，該分型則是以全基因組測(cè)序序列不同進(jìn)行劃分，不同基因型之間核苷酸序列差異超過(guò)8%，因此比血清亞型分型方法更能反映病毒株之間的差異性。HBV基因型呈地理區(qū)域性分布，且不同基因型致病性不同。此外，HBV基因型與乙肝病情的臨床表現(xiàn)、發(fā)生進(jìn)展以及預(yù)后亦密切相關(guān)。

總體而言，乙肝患者血清來(lái)源的HBV具有DNA拷貝數(shù)高、感染力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是最接近天然狀態(tài)的HBV。其缺點(diǎn)主要是乙肝患者血液來(lái)源有限，限制其應(yīng)用于HBV的相關(guān)研究，而且經(jīng)過(guò)抗HBV藥物治療后患者血液中的HBeAg、HBsAg和HBV DNA會(huì)降低甚至消失，其中的病毒活力會(huì)明顯下降。因此需要其他來(lái)源的HBV以替代天然來(lái)源的HBV。

1.2 體外細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)HBV

1.2.1 肝源細(xì)胞系生產(chǎn)HBV 穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞系建立后被廣泛應(yīng)用。1987年，Sells等[5]通過(guò)將首尾相連的2倍HBV基因組整合進(jìn)入HepG2細(xì)胞，從而構(gòu)建成穩(wěn)定表達(dá)乙肝病毒顆粒的HepG2.2.15細(xì)胞系。該細(xì)胞系中HBV可持續(xù)復(fù)制，能產(chǎn)生一定量的病毒感染顆粒，并能檢測(cè)到cccDNA和松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)的產(chǎn)生。其產(chǎn)生的病毒上清注射到黑猩猩體內(nèi)可以誘發(fā)顯著的肝炎癥狀。但該細(xì)胞系中HBV基因組是整合在細(xì)胞染色體上隨細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制，復(fù)制方式與自然情況下不同且病毒復(fù)制量較低。隨著培養(yǎng)代數(shù)增多，其細(xì)胞學(xué)特性與HepG2會(huì)有較大差異，主要抗原表達(dá)量會(huì)逐漸降低。

HepAD38是由HepG2細(xì)胞整合1.1倍的HBV全基因組構(gòu)建而來(lái)，由CMV啟動(dòng)子和四環(huán)素(tetracycline，tet)及其衍生物誘導(dǎo)進(jìn)行調(diào)控表達(dá)，由于其前C區(qū)基因被破壞，所以HBV DNA的產(chǎn)量比HepG2.2.15細(xì)胞要高很多[6]。HepAD79和HepG2-H1.3均整合了1.3倍的HBV全基因組，表達(dá)完全靠HBV自身啟動(dòng)子，更接近于病毒自然狀態(tài)[7]。以上這幾種細(xì)胞系均為在HepG2細(xì)胞染色體中整合不同長(zhǎng)度的HBV基因組構(gòu)建而成的穩(wěn)定表達(dá)HBV的細(xì)胞系。

1.2.2 非肝源細(xì)胞系生產(chǎn)HBV 目前用于生產(chǎn)HBV的非肝源性細(xì)胞非常有限。人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3等轉(zhuǎn)染HBV基因組后可以產(chǎn)生HBV病毒顆粒，上清中檢測(cè)到HBsAg、HBeAg、HBV DNA。但非肝源細(xì)胞裝配和分泌的HBV顆粒與乙肝患者血清來(lái)源或肝癌細(xì)胞系來(lái)源的HBV顆粒有差異，產(chǎn)生病毒量少，且在儲(chǔ)存過(guò)程中DNA容易降解，這些缺點(diǎn)束縛了該類(lèi)細(xì)胞系用于HBV生產(chǎn)[8]。

1.3 HBV質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染生產(chǎn)HBV

綜上，我們將HBV病毒的來(lái)源、構(gòu)建方式、優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)總結(jié)如下(見(jiàn)表 1)。

通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含HBV基因組的質(zhì)粒是生產(chǎn)HBV另一方法。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的細(xì)胞系相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的優(yōu)點(diǎn)是操作步驟簡(jiǎn)單，省去了篩選細(xì)胞的步驟，轉(zhuǎn)染速度快、培養(yǎng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)染率較高，因此安全性也相對(duì)較高。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染需要考慮兩個(gè)因素：一是選擇能夠支持乙肝病毒表達(dá)和復(fù)制的細(xì)胞系，如肝癌細(xì)胞系HepG2，Huh7；二是合適長(zhǎng)度的HBV質(zhì)粒。采用的質(zhì)粒都包括全長(zhǎng)的HBV基因組，往往比HBV本身更長(zhǎng)一些。HBV多種基因型大都包含ayw血清亞型，這可能是通常選用HBV的亞型ayw來(lái)進(jìn)行研究的原因。表達(dá)HBV的質(zhì)粒多采用含CMV強(qiáng)啟動(dòng)子的載體，如pcDNA3等，以啟動(dòng)下游基因的高表達(dá)。另有一些HBV質(zhì)粒并不含外源啟動(dòng)子，完全依靠HBV自身啟動(dòng)子，病毒表達(dá)量比強(qiáng)啟動(dòng)子控制的質(zhì)粒要低。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒后的細(xì)胞不適合長(zhǎng)期培養(yǎng)[9-10]。

表1 HBV病毒來(lái)源比較

2 HBV感染模型

2.1 細(xì)胞模型

2.1.1 PHH/PTH細(xì)胞 人原代肝細(xì)胞(primary human hepatocytes，PHH)支持完整的HBV的感染及復(fù)制[11]，接近自然感染過(guò)程，是HBV感染研究的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，PHH來(lái)源有限，不同捐獻(xiàn)者的遺傳背景差異性大[12]。而且PHH體外培養(yǎng)條件嚴(yán)格，難以大量擴(kuò)增，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)較快去分化，喪失部分肝細(xì)胞特異性功能(如細(xì)胞色素P450水平降低)。這時(shí)，PHH的易感性和支持HBV復(fù)制的能力均降低[12]。研究表明，PHH體外培養(yǎng)易感性快速下降可能與NTCP的表達(dá)量下調(diào)有關(guān)[13]。樹(shù)鼩原代肝臟細(xì)胞(primary tupaia hepatocytes，PTH)也可以支持HBV的體外感染。與PHH相比，PTH無(wú)論在細(xì)胞來(lái)源還是經(jīng)濟(jì)性方面都具有顯著的優(yōu)點(diǎn)。嚴(yán)歡等[14]利用PTH等細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)NTCP是HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞的功能性受體，表明PTH是穩(wěn)定有效的HBV/HDV體外感染研究細(xì)胞模型。但PTH也同樣面臨感染效率不高、體外培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)病毒易感性迅速下降等問(wèn)題。

2.1.2 HepRG細(xì)胞 HepRG是一種人肝臟前體細(xì)胞系，來(lái)源于丙型肝炎引起的肝細(xì)胞肝癌女性患者的肝組織，是少數(shù)對(duì)HBV/HDV易感的細(xì)胞系之一[15-16]。當(dāng)接種密度較低時(shí)，該細(xì)胞快速分裂并且呈現(xiàn)出一種狹長(zhǎng)的未分化形態(tài)。但當(dāng)加入DMSO和氫化可的松琥珀酸酯后，可以分化為兩種類(lèi)型的細(xì)胞：一種是呈現(xiàn)扁平狀、具有清晰細(xì)胞質(zhì)的膽管上皮樣細(xì)胞，其周?chē)鷦t分布著另一種樹(shù)突狀肝樣上皮細(xì)胞。與一般肝癌細(xì)胞系不同，高度分化的HepRG細(xì)胞的生物學(xué)特性(如細(xì)胞色素P450水平和天然免疫因子)很接近PHH，其轉(zhuǎn)錄組圖譜與PHH也高度相似。能相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)持續(xù)6周以上，即使停止DMSO誘導(dǎo)后細(xì)胞色素P450的表達(dá)水平降低，肝特異性轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)不受影響。HepRG細(xì)胞支持HBV的進(jìn)入、基因組復(fù)制、cccDNA形成、感染性病毒顆粒分泌，適用于體外研究HBV生命周期的大部分階段[15]?；谶@些特點(diǎn)，HepRG細(xì)胞模型已成為一種公認(rèn)的可以用于抗病毒藥物研發(fā)以及評(píng)估的有效工具。然而，HepRG仍然有一些不容忽視的缺點(diǎn)，如感染前期DMSO誘導(dǎo)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、感染效率不高。

2.1.3 HepCHLine-4和HLCZ01細(xì)胞 在NTCP發(fā)現(xiàn)以前，蔣嚴(yán)等[17]通過(guò)融合PHH和HepG2細(xì)胞，構(gòu)建了一種支持HBV體外感染的新型細(xì)胞系HepCHLine-4，該細(xì)胞系染色體數(shù)目是PHH和HepG2細(xì)胞染色體數(shù)目之和。當(dāng)用乙肝患者血清感染HepCHLine-4后，能檢測(cè)到rcDNA、cccDNA和HBV顆粒的形成，HBsAg、HBeAg、HBcAg也均能檢測(cè)到。在連續(xù)傳代培養(yǎng)12個(gè)月后，該細(xì)胞系仍具有對(duì)HBV的易感性[17]。另外，Yang等[18]構(gòu)建了一種能同時(shí)支持HBV和HCV體外感染復(fù)制全過(guò)程的新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。該細(xì)胞系分離自男性丙肝患者的肝臟腫瘤組織，實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)兩步膠原灌注法分離、純化腫瘤細(xì)胞，然后挑選合適的克隆注射到NOD/SCID免疫缺陷的小鼠體內(nèi)。兩個(gè)月后，分離小鼠的腫瘤組織獲得若干HLCZ01克隆后傳代培養(yǎng)。用HepG2.2.15細(xì)胞上清和乙肝患者血清分別感染HLCZ01后，cccDNA和HBV上清標(biāo)志物均被檢測(cè)到。與HepRG不同，HLCZ01不需要DMSO誘導(dǎo)分化即可以支持長(zhǎng)達(dá)90 d的病毒感染。該細(xì)胞系在HBV和HCV共感染時(shí)的相互影響、病毒感染時(shí)宿主應(yīng)答機(jī)制、研究抗病毒藥物或疫苗開(kāi)發(fā)方面都有較大的應(yīng)用潛力。

2.1.4 表達(dá)外源性NTCP的肝癌細(xì)胞系 NTCP是一種跨膜糖蛋白，具有鈉離子依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸鹽的功能。2012年，李文輝等人發(fā)現(xiàn)NTCP是HBV和HDV感染進(jìn)入肝細(xì)胞的功能性受體，NTCP在Huh7和HepG2細(xì)胞中的表達(dá)水平很低，約為PHH中表達(dá)量的1/10 000。Huh7和HepG2等人肝癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染外源性NTCP后，可被HBV和HDV感染[19]。Ni等[20]通過(guò)HepRG分化和未分化兩種形態(tài)對(duì)HBV的易感性進(jìn)行的研究同樣證實(shí)了NTCP的功能。基于此，研究人員通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系，成功建立了可以支持HBV體外感染研究的細(xì)胞系(HepG2-hNTCP、 Huh7-hNTCP、 HepRG-hNTCP、 HEK293-hNTCP等)[14，19-22]。有意思的是，只有在HepG2和Huh7表達(dá)人源而非小鼠來(lái)源的NTCP時(shí)，才具有結(jié)合HBV的能力[20]。即人的NTCP包含了HBV表面蛋白PreS1所需的兩個(gè)必要的氨基酸序列，其中第157～163號(hào)氨基酸序列是結(jié)合所必需的，第84～87號(hào)氨基酸序列是感染必需的。而鼠的NTCP缺少第84～87號(hào)氨基酸序列，因此不能被HBV感染[20]。用人NTCP中對(duì)應(yīng)的氨基酸序列替代小鼠NTCP中這段關(guān)鍵序列后，小鼠NTCP即獲得支持HBV感染的能力[21]。

HepRG表達(dá)NTCP水平相對(duì)穩(wěn)定，但Schulze等[23]人發(fā)現(xiàn)減少HepRG細(xì)胞膜間的障礙以便HBV病毒顆?？梢猿浞峙c細(xì)胞基底側(cè)膜接觸，可以有效提高HBV的感染效率。Okuyamadobashi等[24]發(fā)現(xiàn)NTCP在HepG2-NTCP細(xì)胞的基底膜一側(cè)而不是在細(xì)胞頂層膜，這限制了貼壁細(xì)胞的感染效率，因此發(fā)明了一種懸浮感染的方法，可以有效提高感染效率。因此，有效支持體外HBV感染的細(xì)胞系必須同時(shí)具備表達(dá)NTCP且NTCP處于可以與病毒顆粒接觸的狀態(tài)。

表達(dá)NTCP肝癌細(xì)胞系的建立為尋找HBV感染早期尤其是病毒進(jìn)入過(guò)程中新的關(guān)鍵因子的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。Verrier等[25]用HDV和表達(dá)NTCP的Huh7細(xì)胞系為模型研究病毒進(jìn)入過(guò)程，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞膜表面的GPC5是一種HBV和HDV的結(jié)合因子。Michailidis等[26]利用HepG2-NTCP感染模型，發(fā)現(xiàn)兩種干擾素刺激基因IS G20、tetherin限制HBV宿主細(xì)胞間傳遞。Ko等[27]通過(guò)研究HepG2-NTCP細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)DEAD盒RNA解旋酶家族成員DDX3是影響病毒復(fù)制的宿主限制性因素。

表達(dá)外源NTCP的肝癌細(xì)胞系也被用于篩選靶向作用于HBV進(jìn)入的抗病毒藥物。新發(fā)現(xiàn)很多小分子具有抗HBV活性，比如：環(huán)孢菌素A[22]、厄貝沙坦[28]等。Myrcludex B是一種人工合成的乙?；疨reS1短肽，可以結(jié)合NTCP從而阻斷HBV/HDV 進(jìn)入[20，29]。

穩(wěn)定表達(dá)NTCP的HepG2和Huh7等肝癌細(xì)胞系雖然可以支持HBV感染，但感染效率不高(上清中產(chǎn)生的HBsAg和HBeAg水平都很低，甚至檢測(cè)不到HBV DNA)，而用于感染的病毒液滴度甚至高達(dá) 6 000～18 000 GEq/cell[19-20，22]。Iwamoto等[22]構(gòu)建了一株對(duì)患者來(lái)源和細(xì)胞來(lái)源的HBV都敏感的細(xì)胞HepG2-NTCP-C4。感染前用3%DMSO預(yù)處理HepG2-NTCP-C4細(xì)胞系，可以提高感染效率至50%。這提示了NTCP可能不是HBV進(jìn)入過(guò)程的唯一受體或因子，DMSO誘導(dǎo)細(xì)胞分化可以使其他一些未知的分化依賴(lài)性宿主因子表達(dá)。因此，尋找病毒進(jìn)入過(guò)程中的次級(jí)受體或因子也許是建立體外HBV高效感染模型的一個(gè)研究方向。

2.1.5 HLCs細(xì)胞 干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞，可以在體外通過(guò)特定的條件誘導(dǎo)成為類(lèi)肝細(xì)胞(hepatocyte-like cell，HLCs)。人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell，hESC)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS)、臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord matrix stem cells，UMCC)等都可以分化成HLCs，研究證實(shí)HLCs支持HBV的感染和復(fù)制[30-32]。相比于其他的HBV體外感染模型，HLCs的優(yōu)點(diǎn)是可以在體外批量生產(chǎn)、便于高通量篩選、可以具有不同的遺傳背景、篩選個(gè)性化抗病毒藥物等。間充質(zhì)干細(xì)胞分化獲得的類(lèi)肝細(xì)胞具有成熟的肝細(xì)胞功能和分子標(biāo)志物，Paganelli等[30]用HBV對(duì)其進(jìn)行感染，在細(xì)胞的分泌液中檢測(cè)到病毒顆粒和病毒蛋白，但病毒的復(fù)制效率低，優(yōu)點(diǎn)是該細(xì)胞來(lái)源廣泛，適用于HBV感染的早期研究。Xia等[31]誘導(dǎo)hESC和iPS成功分化為HLCs，90%分化后的細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)PHH的標(biāo)志物，如白蛋白、感染所需的特定細(xì)胞因子等，且NTCP的表達(dá)比PHH更穩(wěn)定。用HBV病毒顆粒感染HLCs，HBV DNA、cccDNA、pgRNA、HBeAg和HBsAg都可以被檢測(cè)到，并且應(yīng)用該細(xì)胞系驗(yàn)證了2種宿主靶向抗病毒化合物：genistin和PA452[31]。然而干細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化成本高，誘導(dǎo)分化過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)[33]。相信隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，HLCs作為HBV體外感染模型將會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用。

2.2 動(dòng)物模型

2.2.1 黑猩猩模型 黑猩猩是理想的模擬HBV自然感染過(guò)程的動(dòng)物模型。早在二十世紀(jì)六七十年代，科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)黑猩猩可以被乙肝病毒感染。八十年代后，黑猩猩才被作為模型用來(lái)模擬HBV感染人的過(guò)程。黑猩猩與人類(lèi)無(wú)論在遺傳背景還是生理特征上都高度相似，因此該模型擁有獨(dú)特的優(yōu)越性。用HBV陽(yáng)性患者血清感染黑猩猩后，可以使其產(chǎn)生急性感染和慢性感染，同時(shí)可以產(chǎn)生肝臟炎癥以及與HBV感染患者相仿的免疫應(yīng)答[34]。黑猩猩模型已經(jīng)被用于HBV感染的發(fā)病機(jī)制研究、治療性疫苗療效評(píng)價(jià)、抗病毒藥物篩選等。但使用黑猩猩模型進(jìn)行研究的花費(fèi)十分高昂，而且涉及動(dòng)物倫理，限制了該模型的廣泛使用。Dupinay等[35]近期報(bào)道一種生活在毛里求斯島的食蟹猴，可被來(lái)自人類(lèi)的HBV自然持續(xù)感染，可作為HBV感染動(dòng)物模型。

2.2.2 樹(shù)鼩模型 樹(shù)鼩作為HBV感染的宿主被科研人員發(fā)現(xiàn)則是在二十世紀(jì)八十年代[36]。其外形與松鼠相似，成年后體長(zhǎng)通常約140～195 mm，主要分布在中國(guó)西南省份和東南亞各國(guó)，屬樹(shù)鼩科樹(shù)鼩屬。但成年動(dòng)物人工感染HBV后常表現(xiàn)為急性感染，感染HBV的樹(shù)鼩肝組織中發(fā)現(xiàn)HBV DNA的復(fù)制，血液中也出現(xiàn)了HBsAg的表達(dá)，還能產(chǎn)生包括HBsAb和HBcAb在內(nèi)的針對(duì)病毒抗原的抗體。幼齡期動(dòng)物感染HBV較易形成慢性感染，與人類(lèi)HBV感染過(guò)程相似。由于樹(shù)鼩是野生動(dòng)物，個(gè)體差異較大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。為了解決這個(gè)問(wèn)題，我國(guó)學(xué)者組建了較大規(guī)模的人工繁育樹(shù)鼩種群，深入開(kāi)展了遺傳學(xué)和基因組學(xué)相關(guān)研究，這些工作將促進(jìn)樹(shù)鼩成為可以廣泛應(yīng)用的HBV感染動(dòng)物模型[37]。

2.2.3 人源化小鼠模型 將PHH移植到尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)轉(zhuǎn)基因的免疫缺陷(SCID)小鼠中，該模型已經(jīng)成功應(yīng)用于HBV和HCV的感染，并且可以支持HBV生命周期的全部過(guò)程，但是與PHH一樣，該模型也是一個(gè)特定基因型的有限原代肝細(xì)胞來(lái)源。該嵌合小鼠模型分離出的PHH表現(xiàn)出相當(dāng)高的細(xì)胞色素P450酶和葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性。在PEG的作用下，80%的細(xì)胞可被感染，且上清中可以持續(xù)檢測(cè)到HBV DNA。此外，將PHH移植到延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的小鼠(FRG)中，可使FRG小鼠中人肝細(xì)胞比例將達(dá)到95%[38]。雖然構(gòu)建人肝嵌合小鼠模型費(fèi)用高、步驟復(fù)雜，但可以將PHH擴(kuò)增500～1 000倍，可提供較多對(duì)HBV高度易感的PHH；且獲得具有單一基因型的肝細(xì)胞，減少了不同批次PHH差異性大的問(wèn)題，增強(qiáng)了相關(guān)研究的可重復(fù)性和穩(wěn)定性[39]?；谏鲜鰞煞N小鼠模型都是免疫缺陷模型，不適用于HBV感染過(guò)程中免疫應(yīng)答相關(guān)研究。因此，有人提出通過(guò)多種策略構(gòu)建人免疫細(xì)胞和人肝細(xì)胞雙嵌合小鼠模型，如AFC8和A2/NSG小鼠模型[40]。這種模型能更好的模擬肝炎病毒感染過(guò)程中的免疫反應(yīng)。

3 小結(jié)

HBV感染模型研究的發(fā)展對(duì)揭示病毒與宿主相互作用及反應(yīng)機(jī)制等方面起了非常重要的作用，但仍有許多局限要克服突破。體外培養(yǎng)的PHH對(duì)病毒易感性低。HepRG細(xì)胞培養(yǎng)流程復(fù)雜，常常需要長(zhǎng)達(dá)1個(gè)月以上的誘導(dǎo)分化過(guò)程。穩(wěn)定表達(dá)NTCP的肝癌細(xì)胞系只能部分反映PHH的特性。各種細(xì)胞模型對(duì)感染時(shí)病毒滴度要求不一致，感染時(shí)使用了PEG和DMSO，不能真實(shí)模擬HBV感染人肝細(xì)胞時(shí)的侵入過(guò)程?，F(xiàn)有的HBV體外感染細(xì)胞模型合成cccDNA的水平較低，而cccDNA是慢性HBV感染建立的關(guān)鍵，cccDNA在宿主細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)期存在且目前沒(méi)有可以將其有效清除的藥物。作為篩選新的抗病毒藥物的重要靶點(diǎn)，人們對(duì)cccDNA的認(rèn)識(shí)十分有限，因此開(kāi)發(fā)新的能夠形成較高水平cccDNA的細(xì)胞模型，充分研究其形成和調(diào)節(jié)機(jī)制，尤為迫切。近年來(lái)HBV體外感染模型研究取得了令人矚目的進(jìn)展，一些新技術(shù)如干細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用也為新的HBV體外感染模型提供了支持。研究顯示人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞來(lái)源和人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的HLCs其HBV感染率最高能達(dá)到90%，與PHH最高感染率100%最為接近，且HLCs感染后產(chǎn)生HBsAg和HBeAg的水平與PHH接近[41]。因此HLCs的應(yīng)用為HBV感染研究提供了新的工具[32]。隨著現(xiàn)有HBV感染研究模型的不斷發(fā)展，以及新技術(shù)的應(yīng)用，未來(lái)人們?cè)谝腋尾《靖腥景l(fā)生機(jī)制、病毒和宿主間的相互作用、新疫苗和抗病毒新藥的研發(fā)等領(lǐng)域會(huì)取得更加豐富的成果。