劉 玲,王 丹*,閔可憐,陳 敏,黎熠睿,湛曉蝶,楊青青,崔正旭,田 甲,陳 浩,黃 敏
(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川 綿陽(yáng) 621010;2.四川省原子能研究院,四川 成都 610101)
【研究意義】紅花石蒜(Lycorisradiatavar.radiata),又名龍爪花、蟑螂花,為石蒜科石蒜屬的多年生草本鱗莖植物,原產(chǎn)于日本和中國(guó)[1-3]。石蒜耐寒性強(qiáng),喜陰,也耐干旱,適應(yīng)能力強(qiáng),具有“花葉期不遇”的奇異特性[4]。因其葉片翠綠,花朵具有艷麗的顏色而深受人們的喜愛(ài),是常見(jiàn)的切花材料之一。在園林景色中起到了非常好的調(diào)節(jié)作用,有很高的觀賞價(jià)值,在全世界范圍內(nèi)應(yīng)用廣泛。石蒜屬同屬不同種石蒜在自然條件下能相互雜交形成新的種類,這在植物界是十分罕見(jiàn)的[5]。但是,在自然條件下相互雜交形成的新品種,其大多數(shù)品種不具備遺傳性。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)石蒜的研究主要針對(duì)其生物堿含量,但在其輻照誘變育種方面鮮有報(bào)道[5-6]。
韭蘭(ZephyranthesgrandifloraLindl.),又名韭蓮、風(fēng)雨花,為石蒜科、蔥蓮屬的多年生草本植物,原產(chǎn)于墨西哥、古巴等地,我國(guó)廣東、湖北、貴州、上海等地均有分布[7-8]。韭蘭具有生長(zhǎng)茂盛、開(kāi)花繁盛的特點(diǎn),且鱗莖的分生能力強(qiáng)。在園林中,多作為花壇、花鏡和草地邊緣的點(diǎn)綴,是一種深受人們喜愛(ài)的觀賞性植物,在世界各地均有栽植[9]。我國(guó)引種栽培的韭蘭常出現(xiàn)開(kāi)花卻不留種的情況,只能依靠球莖進(jìn)行無(wú)性繁殖。采用輻照誘變方式對(duì)紅花石蒜和韭蘭進(jìn)行育種的方法較為鮮見(jiàn),采用電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照誘變育種尚未見(jiàn)報(bào)道,所以本研究對(duì)紅花石蒜、韭蘭誘變育種具有很重要的指導(dǎo)意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】輻照誘變育種的主要目的是獲得更多的優(yōu)良突變體,起到?jīng)Q定性因素的是輻照源、輻照劑量以及輻照對(duì)象。輻照誘變育種在最初常采用X射線對(duì)花卉進(jìn)行輻照,并獲得了顯著成效。例如,德國(guó)霍恩瑟內(nèi)[10]采用X射線照射油兼用亞麻獲得1個(gè)新品種;周利斌等[11]采用的8MV X射線結(jié)合無(wú)性繁殖方法對(duì)非洲紫羅蘭進(jìn)行輻照誘變育種,最終培育出了具有穩(wěn)定遺傳的葉綠素缺失的突變體;顧德法[12]采用軟X射線對(duì)早稻進(jìn)行輻射誘變育種,在經(jīng)過(guò)3代的觀察后得出在經(jīng)710-2840 R輻照的早稻出現(xiàn)了較大的變異系數(shù);Ahloowalia B S等[13-14]采用軟X射線對(duì)50個(gè)品種的杜鵑進(jìn)行輻照誘變育種,最終發(fā)現(xiàn)31 %的植株都產(chǎn)生了嵌合體變異的情況。從20世紀(jì)90年代開(kāi)始,我國(guó)便開(kāi)始采用電子束對(duì)植物進(jìn)行輻照誘變育種。目前在禾谷類植物和菊花上獲得了很大的突破。林祖軍等[15]采用電子束對(duì)菊花的4個(gè)品種的組培苗、3種顏色的唐蒼蒲種球和1種顏色的百合種球進(jìn)行輻照誘變育種,發(fā)現(xiàn)處理后的種球均出現(xiàn)了提前開(kāi)花的現(xiàn)象,同時(shí),菊花組培苗經(jīng)過(guò)輻照后花朵出現(xiàn)了2~3株的變異株;張志偉等[16]采用電子束輻照對(duì)唐菖蒲進(jìn)行誘變育種,發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后的百合在M1代花粉活力有所下降;王陽(yáng)等[17]采用電子束對(duì)百合進(jìn)行輻照誘變,發(fā)現(xiàn)電子束嚴(yán)重破壞了當(dāng)代的生殖生長(zhǎng),在M2代中發(fā)現(xiàn)了花朵顏色變深、花瓣斑點(diǎn)長(zhǎng)突起變短的變異株。本次實(shí)驗(yàn)采用新型的輻照方式——電子束轉(zhuǎn)靶X射線,其主要原理是利用電子束轟擊重金屬靶,這種方法不僅具有電子束的優(yōu)點(diǎn),還具有X射線的優(yōu)點(diǎn),簡(jiǎn)單可靠、加工速度快、無(wú)放射源、穿透能力較強(qiáng)、劑量精準(zhǔn)、重復(fù)性好,并可全程劑量跟蹤。利用該技術(shù)對(duì)植物進(jìn)行雙重變異,可以讓育種者在有限的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大量的篩選,提高了育種變異的效率。目前,電子束轉(zhuǎn)靶X射線主要運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、化工等方面。采用這種新型輻照方式對(duì)花卉進(jìn)行輻照誘變育種的方式還未見(jiàn)報(bào)道。
本研究供試材料為石蒜和韭蘭,分別購(gòu)買于四川天香雅源花卉有限公司、四川天喜花卉有限公司。挑選大小基本一致,無(wú)病蟲(chóng)害的種球,其中石蒜平均單重為(12.80±1.40)g,直徑(2.52±0.18)cm;韭蘭的平均單重為(9.29±1.00)g,直徑(2.15±0.16)cm。
有研究表明在進(jìn)行輻照處理時(shí)種球鱗莖的大小、含水量等生理生化指標(biāo)將影響輻照的效果[18-19]。本研究先對(duì)種球鱗莖的重量、含水量、可溶性糖、還原糖和淀粉含量進(jìn)行測(cè)定,以便后期進(jìn)行種間分析。其中,含水量采用烘干法進(jìn)行測(cè)定[20],可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定[21],還原糖采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定[21],淀粉采用蒽酮試劑法測(cè)定[22]。
2017年9月在四川原子能研究院對(duì)韭蘭、石蒜2個(gè)品種的供試種球分別進(jìn)行電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照處理,每個(gè)品種分別設(shè)0、25、50、75和100 Gy 5個(gè)劑量梯度,輻照能量為2 MeV 10 Ma。
本研究將輻照后的韭蘭、石蒜種球種植于西南科技大學(xué)溫室花房?jī)?nèi),按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方式栽植。石蒜每盆6個(gè)種球、韭蘭5個(gè)種球種植盛有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中,花盆規(guī)格為長(zhǎng)49 cm、寬20 cm、高14 cm,各種營(yíng)養(yǎng)土用土比例為生物有機(jī)質(zhì)蚯蚓植物栽培專用:有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土:精致?tīng)I(yíng)養(yǎng)土:礦物蛭石為5∶2∶2∶1。研究考慮到溫室花房?jī)?nèi)不同區(qū)域的環(huán)境條件存在差異,故將種植區(qū)域分為3組,每組花盆按劑量的不同進(jìn)行隨機(jī)排列,各組中每個(gè)劑量下石蒜、韭蘭均設(shè)置3盆。根據(jù)土壤濕度情況,適量澆水。每隔10 d對(duì)種球的出苗率、植株高度、葉片數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),80 d時(shí)對(duì)其最大葉面積進(jìn)行測(cè)定及最長(zhǎng)根長(zhǎng)、根數(shù)進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。
出苗率=出苗株數(shù)/種植種球數(shù)×100 %
本研究運(yùn)用SPSS、Office 2003對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及多重比較、Origin軟件進(jìn)行作圖。
表1不同劑量電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照對(duì)紅花石蒜、韭蘭種球出苗率的影響
Table 1 Effects of X-ray irradiation with different doses of electron beam to target X-rays on the emergence rate of red spider lily andZephyranthesgrandiflora(%)
品種Varieties劑量Dose時(shí)間Time10 d20 d30 d40 d50 d60 d70 d80 d石蒜Lycoris radiata (L’Her.) Herb.0 Gy2.224.4431.1182.2295.5695.5695.5695.5625 Gy0.000.000.006.6737.7866.6771.1186.6750 Gy0.000.002.2215.5628.8980.0091.1193.3375 Gy0.000.000.006.6740.0082.2297.7897.78100 Gy0.000.000.004.4457.7884.4493.3397.78韭蘭Zephyranthes grandiflora Lindl.0 Gy44.4490.7490.7490.7492.5992.5992.5992.5925 Gy0.0079.6390.7492.5992.5994.4494.4494.4450 Gy3.7048.1588.8990.7494.4494.4496.3098.1575 Gy5.5657.4190.7490.7490.7490.7490.7490.74100 Gy16.6753.7083.3383.3388.8988.8988.8988.89
注:1.表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;2. 不同字母之間表示處理間差異顯著(P<0.05)。
Note: 1. The data in the table are average (+standard deviation); 2. There are significant differences between different letters (P<0.05).
2.1.1 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜、韭蘭出苗率的影響 由表1可以看出,紅花石蒜的處理組與對(duì)照組相比,各處理組出苗情況存在不同程度的滯后現(xiàn)象。對(duì)照組在種植10 d時(shí)即出現(xiàn)部分種球出苗,50 d時(shí)達(dá)最大出苗率,為95.56 %;50 Gy處理組在種植20 d時(shí)見(jiàn)部分種球出苗,而25、75、100 Gy處理組均為種植30 d才見(jiàn)部分種球出苗,除25 Gy處理組最大出苗率小于90 %外,其他組出苗率均高于90 %。70~80 d時(shí),25 Gy處理組出苗率增加了15.56 %,而其他組增長(zhǎng)很小或未增長(zhǎng),很大程度上說(shuō)明80 d時(shí)25 Gy處理組未達(dá)最大出苗率,以致其出苗率顯著小于其他組。說(shuō)明輻照雖然造成紅花石蒜種球損傷,使其生命活力減弱,但對(duì)其出苗能力并不產(chǎn)生很大的影響。這可能是由于紅花石蒜種球較大,輻照可能只是對(duì)暴露出種球外的幼芽造成了損傷,而未損傷藏于種球之中的幼苗,因此表現(xiàn)出出芽滯后,而并未對(duì)最大出芽率造成明顯影響。經(jīng)過(guò)輻照處理后的韭蘭種球出苗率表現(xiàn)出與石蒜相似的規(guī)律,其處理組種球的出苗相對(duì)于對(duì)照組均有不同程度的滯后,且最大出苗率間無(wú)顯著性差異。
2.1.2 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)韭蘭、石蒜根生長(zhǎng)、根數(shù)的影響 栽種后第80天時(shí)撥出部分種球,測(cè)量其最長(zhǎng)根長(zhǎng)并統(tǒng)計(jì)根數(shù)。圖1顯示,對(duì)照組的最長(zhǎng)根長(zhǎng)和根數(shù)均顯著高于處理組,處理組間的最長(zhǎng)根長(zhǎng)和根數(shù)基本不存在顯著性差異,但存在隨劑量增大根長(zhǎng)縮短和根數(shù)減少的趨勢(shì),其中石蒜對(duì)照組最長(zhǎng)根長(zhǎng)高出25 Gy組12.56 cm,相應(yīng)的韭蘭高出12.00 cm。說(shuō)明電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照對(duì)石蒜和韭蘭2個(gè)品種根的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的負(fù)影響,且劑量越大影響越大。
不同字母之間表示處理間差異顯著(P<0.05),下同圖1 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜、韭蘭根長(zhǎng)、根數(shù)量的影響Fig.1 Effects of electron beam to target X-rays on length and root number of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
圖2 石蒜、韭蘭各劑量生根情況Fig.2 Rooting situation of different dose of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
圖3 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜、韭蘭株高的影響 Fig.3 Effects of Electron beam to target X-rays on plant height of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
由圖2可以看出,紅花石蒜和韭蘭對(duì)照組的根系均明顯好于處理組,且處理組間均無(wú)明顯差異。這很可能是由于紅花石蒜和韭蘭種球經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線處理后,其原始藏于種球底部表面的根尖分生組織嚴(yán)重受損,但種球可利用其自身儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行新陳代謝,因此表現(xiàn)出輻照處理組也能發(fā)芽出苗,而所出苗生長(zhǎng)狀況差于對(duì)照組。
2.1.3 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜、韭蘭株高影響 本研究所測(cè)株高為單株最長(zhǎng)葉片直立時(shí)頂端到地面的高度,以株高較為穩(wěn)定時(shí)作為測(cè)量的時(shí)間結(jié)點(diǎn)。由圖3可以看出,紅花石蒜、韭蘭種球經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照處理后,各時(shí)間點(diǎn)的株高均顯著低于對(duì)照組,且不同輻照劑量間株高基本無(wú)顯著性差異。70 d時(shí),石蒜對(duì)照組株高達(dá)26.1 cm,而處理組最高僅為5.7 cm;韭蘭對(duì)照組株高達(dá)37.2 cm,而處理組最高僅為8.8 cm。說(shuō)明本研究設(shè)置的各個(gè)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照劑量對(duì)石蒜和韭蘭造成的損傷程度基本相同。
2.1.4 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜、韭蘭最大單葉面積的影響 由圖4可知,在經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線處理后的石蒜、韭蘭植株的最大單片葉面積都顯著低于對(duì)照組,而各處理組之間的最大單片葉面積無(wú)顯著性差異。其中紅花石蒜對(duì)照組最大單片葉面積為18.89 cm2,而處理組中最大單片葉面積為3.44 cm2(100 Gy組最大單片葉面積);韭蘭對(duì)照組最大單片葉面積為21.92 cm2,而處理組中最大單片葉面積為4.39 cm2(25 Gy組最大單片葉面積)。說(shuō)明在本研究設(shè)置的輻照劑量中電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜和韭蘭造成的損傷基本一致。
圖4 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜、韭蘭葉面積的影響Fig.4 Effects of electron beam to target X-rays on leaf area of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
圖5 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜、韭蘭葉片數(shù)量的影響 Fig.5 Effects of electron beam to target X-rays on number of leaves of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
圖6 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜、韭蘭種球內(nèi)含物的影響Fig.6 Effects of electron beam to target X-rays on contents of red spider lily and Zephyranthes grandiflora
2.1.5 電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜、韭蘭葉片數(shù)量的影響 由圖5可知,紅花石蒜、韭蘭種球經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照處理后,各時(shí)間點(diǎn)的葉片數(shù)量均顯著低于對(duì)照組,且不同輻照劑量間葉片數(shù)量無(wú)顯著性差異。說(shuō)明在本研究設(shè)置的輻照劑量中電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)石蒜和韭蘭造成的損傷基本一致。
在植物體內(nèi),可溶性糖作為植物生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo),它同植物的呼吸作用有著密切的關(guān)系,也是植物呼吸的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)植物受到外界的脅迫,會(huì)主動(dòng)積累一些可溶性糖,以便在受到脅迫的環(huán)境中生存。從圖6可以看出,紅花石蒜的可溶性糖呈現(xiàn)出處理組均高于對(duì)照組,處理組之間并無(wú)顯著性差異。其中,對(duì)照組的可溶性糖含量在6.40 %左右,而處理組最高為8.53 %。這說(shuō)明紅花石蒜在受到輻照處理后,主動(dòng)積累了一定的可溶性糖,降低體內(nèi)的滲透式。韭蘭的可溶性糖同紅花石蒜相似,呈現(xiàn)出處理組均高于對(duì)照組。但在經(jīng)輻照后呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),由此可以判斷出韭蘭在受到輻照的脅迫后,降低了韭蘭體內(nèi)的滲透式,是韭蘭對(duì)輻射傷害的應(yīng)激反應(yīng),而下降可能是因?yàn)檩椛鋭┝刻邆α司绿m體內(nèi)的抵御能力,從而呈現(xiàn)除了先上升后下降的趨勢(shì)。紅花石蒜、韭蘭在經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線后的可溶性糖的規(guī)律與生長(zhǎng)情況的各指標(biāo)相似。表明受到輻照后的紅花石蒜和韭蘭均有損傷。
還原糖反映的是植物體內(nèi)碳水化合物的運(yùn)轉(zhuǎn)情況、同時(shí)也是作為呼吸作用的基質(zhì)。它同可溶性糖相似,在植物體內(nèi)起著代謝的作用。如圖6所示,石蒜和韭蘭呈現(xiàn)出的變化規(guī)律有所不同。經(jīng)輻照處理后的紅花石蒜隨著劑量的增加而逐漸降低;經(jīng)輻照后的韭蘭呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢(shì),在75 Gy時(shí)達(dá)到了極值,韭蘭還原糖處理效果次序依次為75 Gy>100 Gy>CK>50 Gy>25 Gy。但紅花石蒜和韭蘭2者的還原糖變化幅度均較小,是否說(shuō)明經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線對(duì)紅花石蒜和韭蘭2個(gè)品種的花卉影響相對(duì)較小,這是否與植物體內(nèi)所含的含水量有關(guān)系還需進(jìn)一步證實(shí)[23]。
淀粉作為植物體內(nèi)的有機(jī)物,是作為能量來(lái)進(jìn)行儲(chǔ)存的。從圖6可以看出,石蒜在經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照后鱗莖中的淀粉含量均大于對(duì)照組,呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì),在經(jīng)100 Gy輻照后達(dá)到最大值,這可能是因?yàn)槭艿捷椪蘸蟛糠值矸坜D(zhuǎn)化為可溶性糖來(lái)維持滲透的平衡。而25、50、75 Gy組間的差異較小,可能是因?yàn)槭庠谑艿捷椪蘸?,自?dòng)控制鱗莖內(nèi)的淀粉含量,調(diào)節(jié)可溶性含量來(lái)維持體內(nèi)的滲透的平衡,表明石蒜在經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線處理后,在25、50、75 Gy中具有一定的耐受性。
紅花石蒜和韭蘭在采用25、50、75、100 Gy的電子束轉(zhuǎn)靶X射線后,均表現(xiàn)出了處理組之間無(wú)顯著性差異,但處理組與對(duì)照組之間差異較大,展現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)特征相似。
電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照劑量25~100 Gy對(duì)紅花石蒜、韭蘭的生長(zhǎng)有著重要的影響,無(wú)論是生理指標(biāo)還是生長(zhǎng)指標(biāo)都照成了一定的傷害。但輻照后的紅花石蒜和韭蘭在輻照劑量為25~100 Gy之間敏感性差異較小,處理組之間主要表現(xiàn)在植株的形態(tài)上受到抑制和損傷,最為顯著表現(xiàn)的為葉片長(zhǎng)度顯著變短、葉面積顯著減小、葉片數(shù)量減少、根長(zhǎng)度減短和數(shù)量明顯減少等現(xiàn)象。說(shuō)明了電子束轉(zhuǎn)靶X射線嚴(yán)重影響了紅花石蒜、韭蘭根的生長(zhǎng)速度和數(shù)量,導(dǎo)致其葉片數(shù)量的減少,葉面積的減小,影響植物的光合作用,從而影響了植物的發(fā)育速度和生長(zhǎng)速度。這與陳睿等[24]得出的2個(gè)品種的杜鵑在60Co-γ射線,輻照劑量為25~65 Gy輻照后結(jié)論基本一致;與趙興華等[25]采用4~6 Gy劑量的60Co-γ射線對(duì)百合鱗莖進(jìn)行輻照的結(jié)論基本一致。因此,在今后的實(shí)際應(yīng)用中,電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照紅花石蒜、韭蘭時(shí)應(yīng)降低輻照劑量。試驗(yàn)測(cè)定紅花石蒜、韭蘭鱗莖中可溶性糖、還原糖以及淀粉的含量??扇苄蕴恰⑦€原糖、淀粉均屬于糖類,糖類含量上升可能是由于低劑量輻照對(duì)植物細(xì)胞的傷害較大,而下降則可能是由于輻射劑量對(duì)植物細(xì)胞的傷害較小。紅花石蒜和韭蘭在可溶性糖、還原糖以及淀粉的趨勢(shì)相似,這是否和植物體內(nèi)的含量相似還有待進(jìn)一步的證實(shí)[23]。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明紅花石蒜和韭蘭在經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照處理后均有抑制作用。
輻射敏感性不同是指不同的植物種類對(duì)輻照劑量的反應(yīng)存在著較大的差異[26]。敏感性可通過(guò)植物對(duì)不同的輻照劑量所引起的一定的遺傳學(xué)效應(yīng)來(lái)進(jìn)行評(píng)定[26-28]。一般情況下,同種植物能接受的輻照劑量大,表示敏感性小,反之則表示敏感性大,這說(shuō)明輻照劑量與敏感程度呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性[29]。紅花石蒜和韭蘭經(jīng)采用25~100 Gy的電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照后無(wú)論是在生長(zhǎng)指標(biāo)還是生理指標(biāo)上表現(xiàn)出來(lái)的特性相似,說(shuō)明了經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線后的紅花石蒜和韭蘭的輻射敏感性相似。
本研究主要探索在電子束轉(zhuǎn)靶X射線這種新型的輻照方式下不同的誘變劑量對(duì)紅花石蒜、韭蘭的生長(zhǎng)發(fā)育影響,以期為成功選育紅花石蒜、韭蘭新品種奠定基礎(chǔ);為經(jīng)電子束轉(zhuǎn)靶X射線輻照的紅花石蒜、韭蘭輻照誘變育種提供了參考。