缺血后處理通過水通道蛋白-4對(duì)大鼠缺血再灌注損傷的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

劉佳麗， 王 曄

腦卒中發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、致死致殘率高、疾病負(fù)擔(dān)重，已躍升為我國國民死因首位。腦卒中分為缺血性腦卒中(Ischemic stroke，IS)和出血性腦卒中，其中IS患者占總發(fā)病人數(shù)的60%～80%[1]許多研究人員認(rèn)為缺血性腦卒中后的腦水腫和血腦屏障(BBB)的破壞引起腦組織損傷，缺血后處理(Ischemic Postconditioning，IP)具有神經(jīng)保護(hù)作用和減輕腦水腫的作用[2]。IP是指在再灌注的早期，重復(fù)予幾次短暫的非致死性的血管閉塞與再通的過程，被認(rèn)為是一種缺血耐受，從而減輕腦缺血再灌注損傷和腦水腫[3]。水通道蛋(AQPs)在腦水腫的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[4]。作為水通道蛋白家族的成員，它們在腦組織中高度表達(dá)，其通常定位于星形細(xì)胞表面以及毛細(xì)血管周圍由星形膠質(zhì)細(xì)胞終足包繞而成的膠質(zhì)界膜。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，AQP4的高表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹破裂，破壞血腦屏障，最終引起缺血再灌注損傷后的腦水腫，進(jìn)而導(dǎo)致腦損傷[5]，它在細(xì)胞毒性和血管源性水腫發(fā)展過程中起著重要的作用。AQP4的表達(dá)增多在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)炎癥和缺血性卒中的病理生理學(xué)中起著重要作用[6]。本研究通過建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察其神經(jīng)行為學(xué)改變、腦組織病理形態(tài)學(xué)變化及海馬區(qū)AQP4的表達(dá)，初步探討IP在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，凋亡檢測試劑盒、AQP4免疫組化試劑盒均為武漢博士得公司產(chǎn)品，OLYMPUS BX41顯微圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 SD大鼠48只，隨機(jī)分為3組，每組16只。假手術(shù)組：僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處。對(duì)照組：行單純大腦中動(dòng)脈缺血60 min后再灌注；缺血后處理(IP)組：于大腦中動(dòng)脈線栓阻閉(middle cerebralartery occlusion，MCAO) 60 min后，拔除線栓后即刻夾閉栓塞側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷血流30 s，恢復(fù)血流30 s，如此進(jìn)行3次缺血/再灌注循環(huán)。

1.2.2 模型制作 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前24 h禁食，自由飲水。水合氯醛0.35 g/kg體重，腹腔麻醉，剪去頸正中位皮毛，消毒，鋪巾，取頸正中皮膚切口，鈍性分離肌肉及皮下組織，暴露頸總動(dòng)脈(CCA)，分離迷走神經(jīng)，切忌鉗夾，鈍性分離右側(cè)頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，結(jié)扎分支，用手術(shù)剪剪開ECA一小口將一預(yù)先用酒精燈燒成圓頭的320尼龍線置入頸內(nèi)動(dòng)脈14～15 mm，直到有輕微阻力感為止，對(duì)照組阻閉60 min后抽出尼龍線，恢復(fù)再灌注，24 h后處死。IP組于MCAO 60 min后，將尼龍線拔出5～8 mm，依據(jù)分組，再灌注時(shí)間30 s，再將尼龍線放入原位置，缺血時(shí)間為30 s，反復(fù)3次，恢復(fù)再灌注，24 h后處死。

1.2.3 觀測指標(biāo)

1.2.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估 麻醉蘇醒后，將動(dòng)物放回鼠籠，自由飲食。腦缺血再灌注后24 h，各組隨機(jī)取8只，用雙盲法評(píng)估記錄神經(jīng)功能障礙評(píng)分(NDS)：0級(jí)：無功能障礙；1級(jí)：不能伸展右側(cè)前肢；2級(jí)：向右側(cè)旋轉(zhuǎn)；3級(jí)：向右側(cè)傾倒；4級(jí)：無自主活動(dòng)伴有意識(shí)障礙；5級(jí)：死亡。

1.2.3.2 梗死體積率測定 所有大鼠恢復(fù)再灌注24 h后，各組隨機(jī)取4只，用10%水合氯醛(3 ml/kg)經(jīng)腹腔注射深麻醉后斷頭處死，迅速取出鼠腦，置于冰鹽水中10 min，取冠狀面均勻切成2 mm厚腦片，迅速放入20 g/L的TTC溶液(37℃)中染色30 min，每隔7～8 min用眼科鑷翻轉(zhuǎn)一次，使染色充分、均勻，然后用40 g/L甲醛固定。24 h后將腦片用數(shù)碼相機(jī)拍照，輸入計(jì)算機(jī)，采用雙盲法用圖像處理軟件(ADOBE PHOTOSHOP 7.0)計(jì)算腦梗死體積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))百分比，即梗死灶占對(duì)側(cè)正常大腦半球的百分比。采用Swanson法的原理計(jì)算腦梗死體積百分比：腦梗死體積百分率=(正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.2.3.3 腦組織含水量測定 大鼠恢復(fù)再灌注24 h后，各組隨機(jī)取4只，用干濕法測腦組織含水。率迅速斷頭取腦，置于內(nèi)有生理鹽水濕潤的定性濾紙的培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)，同時(shí)快速去掉腦皮質(zhì)表面的軟腦膜和凝血塊。用分析天秤準(zhǔn)確稱取兩個(gè)半球的重量，然后置于100 ℃烤箱24 h，用同一天平再次稱重，以[ (濕重-干重) / 濕重] ×100 %即為相對(duì)含水量。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)檢測 每組剩余的8只大鼠，經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。(1)脫蠟、水化組織切片、預(yù)處理組織切片；(2)蒸餾水漂洗，置于PBS中；(3)3%H2O2阻斷10 min；(4)蒸餾水漂洗，置于PBS中10 min；(5)一抗孵育過夜；(6)PBS漂洗3次/2 min；(7)IvisionTM二抗試劑Poly‐HRP羊抗鼠兔通用型；(8)PBS 漂洗3/2 min；(9)顯色，光鏡控制；(10)復(fù)染、脫水、透明、封片；(11)AQP4陽性細(xì)胞不同組別取3張切片，顯微鏡下觀察細(xì)胞漿呈棕黃色為陽性細(xì)胞，OLYMPUS BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測定海馬CA1區(qū)陽性反應(yīng)物的光密度值(optical density value，OD值)，取平均值作為測量值。

1.2.3.5 TUNEL 染色細(xì)胞凋亡檢測 常規(guī)脫蠟，按照試劑說明書操作，DAB顯色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。OLYMPUS BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測定海馬CA1區(qū)陽性反應(yīng)物的光密度值，取平均值作為測量值。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較 術(shù)后所有動(dòng)物均存活。假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能損害，對(duì)照組和IP組大鼠均表現(xiàn)出一定神經(jīng)功能障礙(見圖1)，部分大鼠可觀察到偏癱及霍納征。缺血再灌注24 h后，IP組NDS(1.63±0.74)與對(duì)照組(2.63±0.92)比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.2 大鼠腦梗死體積變化 假手術(shù)組無肉眼可見的梗死灶形成，腦組織染成玫瑰紅色；缺血再灌注各組大鼠均有不同程度的梗死灶形成，腦梗死組織為白色(見圖2)。IP 減小局灶性腦缺血后的梗死體積。IP組腦梗死體積顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 腦組織含水量測定 我們測量了大鼠腦組織水分含量評(píng)估腦水腫。缺血再灌注后假手術(shù)組、對(duì)照組、IP組的非缺血半球側(cè)腦組織水含量在各組別中無明顯差別，患側(cè)腦組織水含量分別為(76.9±0.91)%、(84.08±2.8)%、(79.77±1.81)%。在患側(cè)組中對(duì)照組腦組織水含量明顯高于IP組(P<0.05)(見圖3)，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 凋亡細(xì)胞的表達(dá) 假手術(shù)組海馬CA1區(qū)偶可見極少數(shù)陽性細(xì)胞。缺血再灌注各組大鼠海馬CA1區(qū)可見TUNEL陽性反應(yīng)細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，胞核固縮黃染，胞體縮小形狀不規(guī)則。對(duì)照組可見較多的陽性細(xì)胞，其細(xì)胞核中有大量棕黃色顆粒，細(xì)胞核周圍靠近胞膜處有數(shù)個(gè)散在深染的圓形顆粒狀結(jié)構(gòu)，即凋亡小體(見圖4)。IP組較對(duì)照組陽性細(xì)胞減少，經(jīng)平均光密度值測定，假手術(shù)組平均光密度值最小(0.11400±0.13832)，與其它各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組的OD值明顯高于IP組(P<0.05)(見表2)。

2.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果 AQP4陽性表達(dá)主要集中在大鼠腦膜等處的膠質(zhì)界膜上及毛細(xì)血管壁周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜上和胞漿中，呈現(xiàn)出黃色細(xì)顆粒，在對(duì)照組大鼠海馬區(qū)，AQP4陽性表達(dá)的黃色細(xì)顆粒明顯增多，IP組大鼠海馬區(qū)AQP4陽性表達(dá)的黃色細(xì)顆粒較對(duì)照組減少(見圖5)。圖像分析結(jié)果顯示，對(duì)照組平均光密度值明顯高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；IP組大鼠AQP4的平均光密度值低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

與對(duì)照組相比*P<0.05；與假手術(shù)相比#P<0.01

與假手術(shù)組相比*P<0.01；與對(duì)照組相比#P<0.05

A：假手術(shù)組； B：對(duì)照組； C：IP組

A：假手術(shù)組； B：對(duì)照組； C：IP組

表1 各組大鼠再灌注24 h后

與假手術(shù)組相比較*P<0.01，與對(duì)照組比較#P<0.05

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)平均光密度值

與假手術(shù)組相比較*P<0.01，與IP組比較#P<0.05

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠MCAO作為有效的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驼T發(fā)腦水腫和腦損傷，研究了IP對(duì)腦缺血再灌注后的腦保護(hù)作用。證實(shí)了IP可通過降低AQP4的表達(dá)減小缺血性卒中后的腦水腫，同時(shí)減輕腦損傷后的神經(jīng)功能缺損。

缺血性腦卒中后患者可有不同程度的神經(jīng)功能損傷。大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估提示了缺血性腦卒中后新出現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。對(duì)照組的行為學(xué)評(píng)分明顯高于IP組，可見IP可顯著改善缺血性腦卒中后的神經(jīng)功能缺損。MCAO后可出現(xiàn)大鼠腦缺血缺氧，大量興奮性谷氨酸積累于細(xì)胞外，進(jìn)一步結(jié)合谷氨酸受體后導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，同時(shí)增強(qiáng)了鈣敏感酶的活性，這時(shí)大量自由基生成，損傷線粒體，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。海馬CA1區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的易損部位，本實(shí)驗(yàn)觀察到在缺血后海馬CA1區(qū)可見明顯增加的凋亡細(xì)胞，提示細(xì)胞凋亡參與缺血后細(xì)胞死亡的機(jī)制。假手術(shù)組極少出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，缺血各組海馬區(qū)CA1區(qū)均出現(xiàn)陽性細(xì)胞，IP組較對(duì)照組陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。提示IP可通過減少細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

腦水腫是腦缺血再灌注損傷的重要病理環(huán)節(jié)之一[7]。細(xì)胞毒性腦水腫常常發(fā)生在IS發(fā)生的最初24 h。而血管源性腦水腫則多見于IS的后期，由BBB結(jié)構(gòu)被破壞而引起，腦水腫確切的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明[8]。本研究顯示，IP組與對(duì)照組比較明顯減少了缺血后大鼠的腦梗死體積及腦組織含水量(P<0.05)，表明IP可減輕腦缺血后的腦水腫。在包括卒中，創(chuàng)傷性腦損傷后的腦缺血再灌注所引起的腦水腫均與AQP4的表達(dá)有密切關(guān)系[9]。AQP4屬于水特異性通道蛋白，在腦灰質(zhì)、白質(zhì)均有分布，主要集中在側(cè)腦室和導(dǎo)水管的室管膜細(xì)胞，下丘腦及海馬齒狀回，另外在軟腦膜、視上核、齒狀回的顆粒細(xì)胞層和小腦蒲肯野細(xì)胞也有明顯表達(dá)[10]。AQP4體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AQP4促進(jìn)水通過BBB進(jìn)入損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其表達(dá)水平與細(xì)胞毒性腦水腫程度呈同向變化，二者呈正相關(guān)[11]。AQP4的過度表達(dá)是腦缺血病理過程中腦水腫的主要病理之一[12]。AQP4除了參與腦水腫的病理生理外，還有維持血腦屏障完整性、參與星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移和神經(jīng)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及血管再生等多種功能。許多研究已經(jīng)證明MCAO誘導(dǎo)血腦屏障破壞，AQP4蛋白和mRNA表達(dá)均明顯上升，且在缺血中心的梗死灶周邊表達(dá)最強(qiáng)。之前的研究表明，腦缺血后AQP4基因敲除大鼠的細(xì)胞毒性腦水腫減輕，神經(jīng)功能改善明顯[13]。本研究中腦缺血各組(IP組和對(duì)照組) 海馬CA1區(qū)AQP4表達(dá)均較假手術(shù)組明顯上升，而與對(duì)照組相比IP組AQP4的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，表明IP明顯下調(diào)MCAO后AQP4的表達(dá)，進(jìn)而減少腦梗死后的腦水腫，起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，IP可有效降低腦缺血再灌注后的腦水腫，減輕腦組織損傷和大鼠MCAO后的神經(jīng)功能缺損。其機(jī)制可能與降低AQP4的表達(dá)有關(guān)。