Folin-Ciocalteu比色法測定石榴皮多酚含量條件的優(yōu)化研究

宋振國 吳小瑜 嚴(yán)琳 馬明 程沁園

[摘要]目的 篩選確定Folin-Ciocalteu比色法測定石榴皮提取物中多酚含量的最佳條件。方法 本研究選用沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，確定測定波長后系統(tǒng)考察多酚含量測定過程中Folin-Ciocalteu試劑（FC試劑）濃度、Na2CO3試劑濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等多因素的影響，并對方法學(xué)進(jìn)行考察。結(jié)果 研究表明，采用Folin-Ciocalteu比色法測定石榴皮提取物多酚含量，取樣品液1 ml、40% FC試劑用量5 ml、10% Na2CO3試劑用量4 ml、在20℃避光反應(yīng)100 min為最佳反應(yīng)條件，多酚含量與750 nm處吸光度呈良好線性關(guān)系;本法加標(biāo)平均回收率為99.51%，RSD為2.56%。利用優(yōu)化后的方法測定石榴皮樣品中多酚含量為（142.42±5.88）mg/g。結(jié)論 優(yōu)化后的Folin-Ciocalteu比色法方便穩(wěn)定，是檢測石榴皮中多酚含量的可靠方法。

[關(guān)鍵詞]石榴皮;多酚;Folin-Ciocalteu比色法;回收率

[中圖分類號] R657.32? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（c）-0004-05

[Abstract] Objective To screen and determine the optimal conditions for measurement of polyphenol content in Pomegranate Peel extracts by Folin-Ciocalteu colorimetry. Methods In this study， Gallic Acid was selected as the standard substance. After determining the wavelength of measurement， the effects of Folin-Ciocalteu （FC） reagent concentration， Na2CO3 reagent concentration， reaction time and reaction temperature were investigated systematically， and the methodology was also investigated. Results It was showed that the optimum conditions for the measurement of polyphenols in Pomegranate Peel extracts were： 1 ml sample solution， 5 ml 40% FC reagent， 4 ml 10% Na2CO3 reagent and protected from light at 20℃ for 100 min. The polyphenol content had a good linear relationship with the absorbance at 750 nm. The average recovery rate of this method was 99.51%， and the RSD was 2.56%. The polyphenol content in the Pomegranate leaf sample was determined to be （142.42±5.88） mg/g by the optimized method. Conclusion The optimized folin-ciocalteu colorimetric method is convenient and stable， and is reliable to measure polyphenol content in Pomegranate Peel extracts.

[Key words] Pomegranate Peel; Polyphenol; Folin-Ciocalteu colorimetry; Recovery rate

石榴皮在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中為一味常見中藥，是石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥果皮。諸多研究表明，其果皮、種子、果汁、葉、花等均含有各種對人體有益的營養(yǎng)成分，具有一定的保健和藥用價(jià)值[1-6]。石榴皮中多酚類、黃酮類、有機(jī)酸類和生物堿類等物質(zhì)含量均較高[7-8]，其中石榴皮多酚則是多羥基酚類物質(zhì)的總稱。現(xiàn)代藥理研究證明，石榴皮多酚有清除自由基、抗突變、抑菌、抗癌、抗病毒、消炎以及保護(hù)心血管系統(tǒng)等功能[9-10]。因此，石榴皮多酚在食品、醫(yī)藥、日用化學(xué)品等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用價(jià)值。本研究中所用石榴皮均來自云南蒙自產(chǎn)，利用對Folin-Ciocalteu比色法測量石榴皮含量的各種因素進(jìn)行系統(tǒng)研究與優(yōu)化，從而確定其最佳測定條件，為石榴皮多酚的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

目前常規(guī)測定植物多酚含量的方法有酒石酸亞鐵法[11]、高錳酸鉀法[12]、普魯士蘭法[13]等，但酒石酸亞鐵法對兒茶素類物質(zhì)有專屬性，高錳酸鉀法具有誤差大、操作繁瑣等缺點(diǎn)[14]，普魯士蘭法有測定多酚時數(shù)據(jù)不穩(wěn)定、誤差大等缺點(diǎn)[15]。Folin-Ciocalteu法比較簡單，是植物多酚類物質(zhì)常用的測定方法。但植物來源不同，會導(dǎo)致分析條件不同[16-18]。因此對石榴皮中多酚類有必要探索一個簡單、科學(xué)、準(zhǔn)確的分析方法。本研究采用Folin-Ciocalteu比色法測定石榴皮中多酚類含量，并對Folin-Ciocalteu試劑（FC試劑）用量、Na2CO3試劑用量、反應(yīng)時間等因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了測定石榴皮中多酚類含量的方法，為石榴皮的利用提供基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器、試劑

UV-1800PC-DS2型紫外—可見光分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;752型紫外—可見光分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;B-220型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（北京世紀(jì)華科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;FC試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;其他均為上海國藥試劑集團(tuán)分析純試劑。

1.2試藥

石榴皮，取自云南蒙自石榴果園，經(jīng)本校藥學(xué)系中藥教研室蔣燕老師（執(zhí)業(yè)中藥師）鑒定為石榴科石榴屬植物Punica granatum L.的果皮;沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，批號110831-201605）。

2方法與結(jié)果

2.1樣品制備

2.1.1對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.04 g沒食子酸，用蒸餾水溶解并定容至1000 ml容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度為40 μg/ml的對照品溶液，避光保存。

2.1.2供試品溶液

將新鮮石榴皮洗凈，50℃鼓風(fēng)干燥24 h，粉碎，過40目篩。稱取該粉末100 g，加70%乙醇配成料液比為1∶20的溶液，攪勻，保鮮膜封口，在超聲清洗儀中（50℃）超聲30 min。過濾，并在40℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干燥，得石榴皮提取物干粉5.4 g。精確稱取提取物干粉0.2 g，精密配制成質(zhì)量濃度為200 μg/ml的樣品液。

2.2多酚含量測定的影響因素試驗(yàn)

2.2.1最佳測定波長的確定

精確移取1.0 ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和石榴皮多酚溶液，參照茶葉多酚的測定方法[19]，分別加入5.0 ml濃度為10%（V/V）FC試劑，靜置2 min，加7.5%（V/V）Na2CO3試劑4.0 ml，使其充分反應(yīng)，室溫避光120 min。以空白試劑為對照，用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm波長下全波長光譜掃描。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、石榴皮多酚溶液分別與FC試劑反應(yīng)后的光譜曲線有相似的形狀，出現(xiàn)了2個吸收峰值，分別是330 nm和750 nm。在330 nm處，F(xiàn)C試劑本身有吸收峰，因此測定石榴皮多酚含量可選用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，750 nm為測定最佳波長。

2.2.2石榴皮多酚含量測定的影響因素試驗(yàn)

2.2.2.1 FC試劑濃度的影響試驗(yàn)? 取50 ml容量瓶，加入1.0 ml石榴皮多酚液，再依次加入5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的FC試劑，按照2.2.1確定的最佳條件依次測定吸光度值（A750值）。隨著FC試劑濃度的增加，石榴皮多酚溶液的A750值先增高后降低。在FC試劑濃度為40%時達(dá)到最大值，其后隨著濃度的增加而下降。當(dāng)FC試劑濃度達(dá)60%時，反應(yīng)液漸有氣泡發(fā)生（反應(yīng)產(chǎn)生CO2），且隨著濃度進(jìn)一步的增加，反應(yīng)液氣泡量隨之增多，需排除后才能測定。FC試劑濃度達(dá)80%后，反應(yīng)液出現(xiàn)沉淀，對吸光度的測定產(chǎn)生不利影響。因此選擇40%作為FC試劑的最佳濃度。

2.2.2.2 Na2CO3試劑濃度的影響試驗(yàn)? 精確移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，加入40%FC試劑液，并行加入不同濃度的Na2CO3試劑（濃度分別為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%），按照2.2.1中確定的最佳條件測定A750值。石榴皮多酚液的吸光度隨Na2CO3試劑濃度的增大而上升。當(dāng)Na2CO3試劑濃度為5.0%時，反應(yīng)液呈黃綠色，反應(yīng)不完全，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[20]。當(dāng)Na2CO3試劑濃度達(dá)10%時，石榴皮多酚溶液的A750值達(dá)到最大，后隨著濃度的增加而緩慢下降。因此選擇10%作為Na2CO3試劑最佳濃度。

2.2.2.3反應(yīng)溫度的影響試驗(yàn)? 精確移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，加入濃度為40%的FC試劑和10%的Na2CO3試劑，分別在溫度為20、25、30、35、40℃的條件下，按照2.2.1中確定的最佳條件分別測定A750值。石榴皮多酚溶液的A750值隨反應(yīng)溫度變化不大。在反應(yīng)溫度20℃后略有下降，至35℃后止降后稍有上升。在20℃時，石榴皮多酚溶液的A750值達(dá)到最大。因此，確定20℃為反應(yīng)最適溫度。

2.2.2.4反應(yīng)時間的影響試驗(yàn)? 精確移取1.0 ml石榴皮多酚溶液，按照2.2.1中方法進(jìn)行試驗(yàn)（40%FC試劑、10%Na2CO3試劑、反應(yīng)溫度20℃），每隔20 min測定A750值，直至180 min。石榴皮多酚溶液的吸光度隨反應(yīng)時間的增加出現(xiàn)先升后降的趨勢，但整體變化幅度不大。在100～120 min時出現(xiàn)峰值，故選擇100 min作為反應(yīng)最適時間。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

篩選出如上測定條件并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別精確量取濃度為0、15、30、45、60、75 μg/ml的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1.0 ml，平行加入40% FC試劑5.0 ml，混勻，靜置2 min，加入10% Na2CO3試劑4.0 ml，搖勻，25℃下避光反應(yīng)100 min，測定A750值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程式為：y=0.01475x+0.00686，R2=0.99980。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與質(zhì)量濃度在0～75 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，該方程可用于石榴皮提取液中多酚含量的計(jì)算。

2.4 FC比色法測定效果的評定

2.4.1穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照優(yōu)化條件進(jìn)行顯色反應(yīng)后，測定4℃下分別放置2、3、4、5、6和7 h時石榴皮多酚溶液的A750值，檢測FC法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，石榴皮多酚溶液的A750值依次為0.427、0.424、0.419、0.408、0.399、0.386。數(shù)據(jù)顯示，石榴皮多酚溶液的A750值在7 h內(nèi)變化很小，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）=1.59%，提示該方法穩(wěn)定性良好。

2.4.2精密度試驗(yàn)

分別精確移取6份1.0 ml石榴皮多酚溶液置比色管中，按照優(yōu)化后條件進(jìn)行A750值測定，計(jì)算RSD，評價(jià)儀器的精密度。結(jié)果顯示，對樣品進(jìn)行平行測定的A750值分別為0.427、0.429、0.445、0.419、0.438、 0.399，6次測定結(jié)果的RSD為1.73%，提示儀器的精密度良好。

2.4.3回收率試驗(yàn)

按上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的條件，采用加標(biāo)回收法，分別測定已知含量的石榴皮多酚提取液加入不同量（高、中、低水平）的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品后的多酚含量，并計(jì)算其回收率和RSD（表1）。表1可見，用該方法對石榴皮多酚含量測定時，沒食子酸的加標(biāo)回收率為96.48%～102.05%，平均回收率為99.51%，RSD為2.56%（n=5），提示該方法準(zhǔn)確度較高，可用于石榴皮多酚含量測定。

2.5樣品測定

制備1.0 ml石榴皮多酚供試液6份，按照優(yōu)化后條件進(jìn)行A750值測定，計(jì)算石榴皮樣品中多酚的含量。經(jīng)測，石榴皮多酚溶液A750=0.4270±0.0173，計(jì)算得石榴皮多酚溶液的含量為（142.42±5.88）mg/g。

3討論

中藥材多酚含量的檢測常采用光譜法和色譜法，前者包括分光光度法、紅外光譜法和核磁共振光譜法，高效液相色譜法、薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法等均為后者常見的檢測方法[21]。其中，UV-FC法為最廣泛應(yīng)用的總酚含量測定方法。其原理為鎢鉬酸在pH顯堿性的環(huán)境條件下，能夠被酚類物質(zhì)還原（W6+變?yōu)閃5+），還原產(chǎn)物中藍(lán)色絡(luò)合物的深淺與多酚含量多少成正相關(guān)。Folin-Ciocalteu法具有重現(xiàn)性好、快速、穩(wěn)定精密度高、回收率佳、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道不同石榴皮原料多酚含量測定條件，如測定波長、FC試劑用量、顯色溫度、顯色時間以及堿液濃度等測定條件有著較大差異[22]。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)C法測定石榴皮提取物中多酚含量的最佳條件為：取樣品液1 ml、40% FC試劑5 ml、10% Na2CO3試劑4 ml、在20℃避光反應(yīng)100 min為最佳反應(yīng)條件;多酚含量與750 nm處吸光度呈良好線性關(guān)系;本法加標(biāo)平均回收率為99.51%，RSD為2.56%。

Folin-Ciocalteu測定多酚含量時易受其他還原性物質(zhì)如還原糖類、芳香氨基酸、抗壞血酸等物質(zhì)的干擾[23]，這些物質(zhì)對石榴皮多酚含量測定的影響有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，優(yōu)化后的Folin-Ciocalteu比色法方便穩(wěn)定，是檢測石榴皮中多酚含量的可靠方法。

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（收稿日期：2018-05-09? 本文編輯：任秀蘭）