中藥康萊特聯(lián)合放化療對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及機制

姚 ?。?，信紅亞，3＊，曾貴榮＊，石鎮(zhèn)港，吳莉峰，徐永興，袁湘中，王 平

（1.吉林省人民醫(yī)院，吉林長春 130021；2.湖南省藥物安全評價研究中心暨新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410331；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008）

放射治療作為治療肺癌的主要手段之一，在殺傷腫瘤細胞的同時，會損傷免疫細胞，且伴隨著一些嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制和消化道反應(yīng)等［1］。因此，探討有效治療方法預(yù)防、減輕或遏制腫瘤放療患者不良反應(yīng)的發(fā)生、提高患者生存質(zhì)量具有重要意義。近年來研究證實，中醫(yī)藥聯(lián)合放療能通過調(diào)節(jié)免疫、抗氧化應(yīng)激、抗炎、維持腸道微生物平衡等發(fā)揮作用［2］。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，中藥康萊特（主含薏苡仁）注射液（Kanglaite injection，KI）、康萊特軟膠囊（Kanglaite soft capsule，KC）配合化療均能明顯提高晚期非小細胞肺癌患者免疫功能，提高患者生存質(zhì)量，減輕副作用［3］。而KI和KC聯(lián)合放化療對非小細胞肺癌治療作用未見報道。因此，本研究對KI和KC聯(lián)合放化療對Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用進行探討，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞、試劑和主要儀器

雄性C57BL/6小鼠116只，體質(zhì)量12～15 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號（43004700046836）；倫理審查編號為2018（3）014，在湖南省藥物安全評價研究中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，溫度：20～26℃、相對濕度：40%～70%、每日12 h/12 h交替照明，小鼠自由進食和飲水。小鼠Lewis肺癌細胞，購于中國科學(xué)院細胞庫，用DMEM培養(yǎng)基加10%新生牛血清，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。KI（批號：1803136-1，規(guī)格：10 g/100 mL）；KC（批號：20180302，規(guī)格：0.45 g/粒，浙江康萊特藥業(yè)有限公司）。順鉑注射液（批號：170905，規(guī)格：30 mg/6 mL，江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司）。水合氯醛（批號：20171221，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。用FITC-CD3小鼠單抗（貨號11-0032-82）、APCCD4小鼠單抗（貨號17-0041-820）和PE-CD8a小鼠單抗（貨號12-0081-82）（均為美國Thermofisher公司產(chǎn)品），X-RAD 225 Cx小動物精確放療系統(tǒng)（美國SARRP公司）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺（永康正豐五金有限公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；DFC 420C型病理成像系統(tǒng)（德國Leica）。

1.2 荷瘤小鼠制備及處理分組

取對數(shù)生長期Lewis肺癌細胞，調(diào)整細胞濃度為1×1010L-1細胞液接種于20只雄性C57BL/6小鼠右側(cè)腋下，每只小鼠接種0.2 mL（約2×106個細胞），待腫瘤組織≥500 mm3，剝離腫瘤組織按體積1∶1加細胞培養(yǎng)液，用勻漿器制備細胞懸液接種于84只雄性小鼠背部，腫瘤體積≥200 mm3且無潰破時，荷瘤小鼠模型制備成功。

按瘤體體積兼顧體質(zhì)量分為7組，每組12只，分別為：荷瘤模型組、放療（Rad）組、放療+5 d順鉑2 mg·kg-1（Rad+Cis×5）組（iv給藥）、放療+5 d KI組（Rad+KI×5）、放療+5 d KI+11 d KC組（Rad+KI×5+KC×11）、放療+16 d KI組（Rad+KI×16）、放療+順鉑2.0 mg·kg-1+5 d KI+11 d KC組（Rad+Cis+KI×5+KC×11），KI均按13 mL·kg-1iv給予，KC按1.4 g·kg-1ig給予。另取12只C57BL/6小鼠作為正常對照組。除正常對照組外，其余小鼠采用225 Cx放療系統(tǒng)進行瘤體放療，方法如下：采用10%水合氯醛ip麻醉小鼠，置自制鉛衣中、暴露腫瘤組織進行放療，放射強度為2 Gy·d-1，連續(xù)照射5 d，正常對照組、荷瘤模型組和Rad組小鼠按20 mL·kg-1靜脈給予0.9%氯化鈉注射液，其余各組按實驗設(shè)計分別給予相應(yīng)藥物，16 d后，各組小鼠取血、胸腺和脾進行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 計算小鼠死亡率

記錄每天小鼠死亡情況，小鼠死亡率（%）=死亡小鼠數(shù)/總小鼠數(shù)×100%。

1.4 測量瘤體積和瘤重

每3天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織最長徑（a）和最短徑（b），瘤體積（V）=1/2ab2。末次給藥后解剖取腫瘤組織稱重（g），抑瘤率（%）=（荷瘤模型組瘤重-給藥組瘤重）/荷瘤模型組瘤重×100%。

1.5 血液生化儀檢測血常規(guī)

末次給藥后小鼠眼眶取血，采用血液生化儀檢測血常規(guī)：白細胞（white blood cells，WBC）和紅細胞（red blood cells，RBC）計數(shù)，血紅蛋白（hemoglobin，Hgb）含量。

1.6 流式細胞儀檢測外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+細胞亞群百分比

末次給藥結(jié)束后取血，用5倍量RBC裂解液裂解RBC，用CD3，CD4和CD8抗體0.25 mg·L-1進行標(biāo)記，孵育后上機檢測。

1.7 骨髓涂片觀察巨核細胞、紅細胞系和粒細胞系變化

末次給藥后取股骨進行骨髓涂片，分離小鼠一側(cè)完整股骨，剪去兩端骨骺，用PBS將全部骨髓沖洗至2 mL離心管，進行骨髓涂片，觀察巨核細胞、RBC系和粒細胞系有無細胞增生、細胞發(fā)育異常。巨核細胞的發(fā)育異常主要表現(xiàn)為巨核細胞不能分葉或分葉減少和小核巨核細胞等。RBC系細胞發(fā)育異常主要表現(xiàn)為幼紅細胞可見多核、異形核及類巨變等，補充維生素B12、葉酸后RBC形態(tài)異常不能糾正。粒細胞系細胞發(fā)育異常表現(xiàn)為胞漿顆粒缺少、類巨變、異形核、假性Pelger-Hüet畸形等。

1.8 臟器指數(shù)計算

末次給藥后解剖取胸腺、脾并稱重，計算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量/動物體質(zhì)量×100，單位為g·100 g-1）

1.9 HE染色觀察胸腺和脾組織病理變化

將胸腺、脾用10%甲醛進行固定，石蠟切片進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察胸腺、脾組織病理變化。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠死亡率的影響

小鼠死亡率結(jié)果（圖1）顯示，與荷瘤模型對照組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5和Rad+KI×16各組小鼠死亡率明顯降低（P＜0.01）。與Rad組比，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+Cis×5和Rad+KI×16，Rad+KI×5各組小鼠死亡率明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），但是Rad+KI×5+KC×11組小鼠死亡率升高（P＜0.05）。與Rad+Cis組比，Rad+KI×5 組小鼠死亡率明顯降低（P＜0.05），提示KI和KC聯(lián)合放化療能明顯提高小鼠生存率。

Fig.1 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on death rate of Lewis lung cancer mice.Totally 84 tumor-bearing mice with tumor size over 200 mm3were collected and divided into seven groups according to tumor size and mass：tumor-bearing model group，radiation therapy（Rad）group，Rad+cisplatin 2 mg·kg-1（Rad+Cis）group，Rad+5 d Kanglaite injection（KI）13 mL·kg-1（Rad+KI×5）group，Rad+5 d KI+11 d Kanglaite soft capsule（KC）1.4 g·kg-1（Rad+KI×5+KC×11）group and Rad+KI×16 group，Rad+Cis+KI×5+KC×11 group，the tumor-bearing mice underwent radiation therapy for 5 d，radiation intensity was 2 Gy per day.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Rad group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.2 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠瘤體積的影響

與荷瘤模型對照組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠給藥第6～15天瘤體積明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；Rad+KI×5和Rad組小鼠第6和9天瘤體積明顯降低（P＜0.05），Rad+Cis×5組小鼠第9天瘤體積明顯降低（P＜0.05），與Rad 組、Rad+Cis×5組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠給藥第12～15天瘤體積明顯降低（P＜0.01），提示KI和KC聯(lián)合放化療對Lewis肺癌荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤作用（表1）。

2.3 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠瘤重的影響

小鼠瘤重結(jié)果（圖2）顯示，與荷瘤模型對照組比較，除Rad+KI×5+KC×11組無統(tǒng)計學(xué)差異外，其他組小鼠瘤重明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與Rad組、Rad+Cis組比，Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠瘤重明顯降低（P＜0.05），提示KI和KC聯(lián)合放化療能明顯降低小鼠瘤重。

Fig.2 Effect of Kanglaite combined with chemradiotherapy on tumor mass in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group；#P＜0.05，compared with the Rad group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.4 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠RBC，Hgb和WBC的影響

小鼠RBC，Hgb和WBC結(jié)果（圖3）顯示，與正常對照組比較，荷瘤模型對照組小鼠RBC數(shù)、Hgb含量明顯降低（P＜0.01），WBC數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與荷瘤模型對照組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11和Rad+KI×16組小鼠RBC數(shù)和Hgb含量明顯升高（P＜0.05），提示Rad+Cis+KI×5+KC×11和Rad+KI×16具有明顯的升RBC和Hgb的作用。與Rad和Rad+Cis×5組比，各藥組RBC數(shù)，Hgb含量無統(tǒng)計學(xué)差異。與荷瘤模型對照組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11組和Rad+Cis×5組小鼠WBC數(shù)明顯降低（P＜0.01）。與Rad+Cis×5組比，Rad+KI×5，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各組小鼠WBC數(shù)明顯升高（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on tumor volumes of Lewis lung cancer mice

Fig.3 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on red blood cell（RBC），hemoglobin（Hgb）and white blood cell（WBC）in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.05，compared with model group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.5 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠胸腺和脾指數(shù)的影響

與正常對照組比較，荷瘤模型對照組小鼠胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01），脾指數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與荷瘤模型對照組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠胸腺指數(shù)明顯增加（P＜0.05），脾器指數(shù)明顯降低（P＜0.05），Rad組Rad+KI×5組和Rad+IK×16組小鼠胸腺器指數(shù)明顯增加（P＜0.05）。與Rad組和Rad+Cis×5組比較，各給藥組小鼠胸腺和脾指數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。

Fig.4 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on thymus and spleen coefficients in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group.#P＜0.05，compared with model group.

2.6 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細胞亞群百分比的影響

與正常對照組比較，荷瘤模型對照組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞亞群百分比明顯降低（P＜0.05）。與荷瘤模型組相比，Rad+Cis+KI×5+KC×11、Rad、Rad+Cis×5和Rad+KI×16各組小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞亞群百分比明顯升高（P＜0.05）。與Rad組和Rad+Cis×5組比較，各給藥組小鼠外周血T淋巴細胞亞群CD3+CD4+百分比無明顯差異。各組小鼠外周血CD3+CD8+T淋巴細胞亞群百分比無明顯差異（圖5）。

2.7 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠骨髓細胞的影響

正常對照組小鼠骨髓巨核細胞核體積大，胞漿豐富，骨髓有核細胞增生活躍，成熟紅細胞和有核細胞的比例大致正常，紅細胞系和粒細胞系大量存在，分布集中。在荷瘤模型組中，巨核細胞減少（P＜0.01），紅細胞系和粒細胞系遭到破壞，分布較為疏散。給藥后，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各組小鼠骨髓有核細胞明顯增加（P＜0.01，P＜0.05），與Rad+Cis×5組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各組小鼠骨髓有核細胞明顯增加（P＜0.05）（圖6）。

Fig.5 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on CD3+CD4+and CD3+CD8+percentage of T lymphocyte subsets in peripheral blood of Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group.#P＜0.05，compared with model group.

2.8 康萊特聯(lián)合放化療對荷瘤小鼠胸腺和脾組織病理變化的影響

荷瘤模型對照組小鼠脾紅髓造血明顯，細胞類型多樣，紅細胞系、粒細胞系、巨核細胞均增生，胸腺萎縮，殘存部分小葉，皮髓質(zhì)分界不清。Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠脾白髓僅見少量淋巴組織，紅髓造血明顯，細胞類型多樣，以粒細胞系為主，胸腺萎縮，皮髓質(zhì)分界不清。與Rad組和Rad+Cis×5組比較，Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠脾白髓紅髓造血明顯，細胞類型多樣，以粒細胞系為主（圖7）。

Fig.6 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on bone marrow cells in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.B was count of bone marrow nucleated cells（BMNCs）of A.±s，n=12.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the model group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.The arrows show megakaryocytes.

Fig.7 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on pathology of spleen and thymus in Lewis lung cancer mice by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.The black arrows show extramedullary hematopoietic granulocytes of the spleen and the shrunken thymus.The red arrows show the medulla，and the thymus is atrophic.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Rad+KI×5、Rad+KI×16能明顯降低小鼠死亡率，降低瘤體積和瘤重，提示KI聯(lián)合放療具有明顯抑瘤作用。其次，Rad+KI×16能明顯升高小鼠血常規(guī)指標(biāo)RBC和Hgb含量，Rad+KI×5、Rad+KI×16對小鼠骨髓抑制有明顯的改善作用，升高小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴細胞亞群百分比，Rad+KI×5能明顯增加胸腺指數(shù)，且對胸腺、脾病理學(xué)變化未見異常，提示KI聯(lián)合放療對骨髓造血抑制具有一定的修復(fù)作用，且無明顯的副作用。與Rad+Cis×5組比較。Rad+Cis+KI×5+KC×11組小鼠死亡率明顯降低，瘤體積和瘤重降低，提示KI和KC聯(lián)合放化療抑瘤作用優(yōu)于放化療。Rad+Cis+KI×5+KC×11能明顯升高血常規(guī)指標(biāo)RBC和Hgb含量、外周血CD3+CD4+T淋巴細胞亞群百分比，對胸腺和脾器指數(shù)及組織病理變化無明顯影響。提示KI和KC聯(lián)合放化療能明顯改善骨髓抑制，且能減少放化療對免疫器官的副作用。Rad+KI×5+KC×11組小鼠死亡率升高，KI聯(lián)合放療6 d瘤體積有降低趨勢，ig KC至給藥結(jié)束，瘤體積、瘤重變化與模型對照組無明顯差異，提示KI聯(lián)合放療前期給藥有明顯的抑瘤作用，而后單獨給予KC效果不明顯，因此小鼠死亡率增加與后期單用ig KC作用有關(guān)。

目前癌癥治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療，放療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞也會造成損傷，產(chǎn)生胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、免疫抑制或心、腎和神經(jīng)系統(tǒng)的損害［4］。骨髓抑制是其中最主要的副作用是導(dǎo)致機體免疫功能低下，主要臨床表現(xiàn)為外周血紅細胞顯著減少［5］。KI為雙相廣譜抗癌藥，臨床用于肝癌和肺癌的治療。臨床研究報道，KI配合放療能明顯提高非小細胞肺癌患者的療效及患者免疫功能，且具有增效減毒的作用，其機制可能是康萊特能改善由放療引起的腫瘤低氧及免疫抑制微環(huán)境［6-7］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，KI聯(lián)合放療對肺癌患者有著明顯的治療作用，可明顯降低肺癌細胞的生長和擴散［8-11］。KI和KC主要含有薏苡仁，薏苡仁中的主要抗腫瘤活性成分對肝癌、胃癌和肺癌等均具有較好療效且副作用?。?，7］。且KC對荷瘤小鼠具有明顯的免疫促進作用，能增強機體非特異性免疫和抗疲勞能力［12］。

綜上所述，KI和KC聯(lián)合放化療對Lewis肺癌小鼠具有明顯的增效抑瘤、減毒作用，其作用機制與增強免疫有關(guān)。該研究為提高腫瘤患者機體免疫功能、減輕放療副作用、提高生存質(zhì)量提供了新的選擇。