基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的紅花如意丸治療婦科疾病作用機(jī)制研究Δ

郭思宇，吳嘉瑞，周 唯，賈珊珊，張景媛，孟子琦，倪夢蔚，劉殊羽

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488)

紅花如意丸的藏文名為“古格桑培”，是在傳統(tǒng)經(jīng)典藏藥方“二十五味鬼臼丸”的基礎(chǔ)上加減而成的藏成藥，其主要組方藥物包括紅花、西紅花、桃兒七、訶子、藏茜草、肉桂、巴夏嘎、藏木香、芫荽果、降香、硇砂和熊膽等26味，主要功效有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、調(diào)經(jīng)血和祛斑，還可用于婦女血癥、風(fēng)癥、陰道炎、心煩血虛、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)及小腹冷痛等疾病[1-3]。英國藥理學(xué)家Hopkins于2007年首先提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念，其主要是以系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等學(xué)科為理論基礎(chǔ)，利用網(wǎng)絡(luò)可視化、網(wǎng)絡(luò)組學(xué)分析等方法，揭示“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，預(yù)測藥物的藥理學(xué)作用機(jī)制[4-7]。中藥具有成分復(fù)雜、系統(tǒng)龐大、多組分和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠整體、系統(tǒng)地探索藥物、靶點(diǎn)和疾病之間的相互作用，直觀反映及揭示中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系，其研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)從整體觀念、辨證論治角度診治疾病的理論有著異曲同工之妙，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的預(yù)測及作用機(jī)制研究，為復(fù)雜中藥的系統(tǒng)研究提供了新的思路和方法[8-12]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對紅花如意丸中所含部分藥物的多成分、多靶點(diǎn)和多種疾病之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行研究，以期為揭示紅花如意丸治療婦科疾病作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

1 資料與方法

1.1 紅花如意丸的化學(xué)成分

依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中草藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicine database @Taiwan，TDT)(http：//tcm.cmu.edu.tw)以及中國知網(wǎng)(CNKI)，檢索紅花如意丸中主要組方藥物紅花、西紅花、桃兒七、訶子、藏茜草、肉桂、巴夏嘎、藏木香、芫荽果、降香、硇砂和熊膽的化學(xué)成分。共搜集到454個(gè)化合物，其中紅花189個(gè)，西紅花70個(gè)，訶子41個(gè)，降香98個(gè)，肉桂5個(gè)，熊膽9個(gè)，巴夏嘎4個(gè)，藏木香16個(gè)，桃兒七8個(gè)，芫荽果13個(gè)，硇砂1個(gè)，未檢索到藏茜草的化學(xué)成分。

1.2 篩選化學(xué)成分

本研究中，為了使結(jié)果更具有準(zhǔn)確性、代表性，篩選條件為：將化合物口服利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)的閾值分別設(shè)置為OB≥30%，DL≥0.18；刪除重復(fù)、沒有活性的化合物。通過篩選，共有73個(gè)化合物符合條件，作為候選化合物。

1.3 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)和“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

Cytoscape是一種開放源碼的生物信息分析軟件，以網(wǎng)絡(luò)為其核心架構(gòu)，節(jié)點(diǎn)可用來代表基因、蛋白質(zhì)或分子等，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)間連接的邊則代表其之間的相互作用關(guān)系[13]。利用Cytoscape 3.6.1軟件(https：//cytoscape.org)構(gòu)建紅花如意丸的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)、“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)以及“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，探究紅花如意丸的藥理學(xué)作用機(jī)制。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

String數(shù)據(jù)庫是一種可以用來儲存已知或者預(yù)測的蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫，可以比較直觀地反映蛋白質(zhì)間的直接或間接的相互作用關(guān)系，每個(gè)蛋白質(zhì)相互作用信息均有相應(yīng)的評分，分值越高，說明蛋白質(zhì)間相互作用置信度越高[14]。為了說明靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將紅花如意丸相關(guān)靶點(diǎn)基因上傳至在線String 10.5數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org)，選取分值>0.7分的置信度數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件(https：//cytoscape.org)構(gòu)建相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體(gene ontology，GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

David是一種整合多種類別的數(shù)據(jù)庫資源的數(shù)據(jù)庫，其利用改進(jìn)的Fisher精確檢驗(yàn)算法對基因集進(jìn)行富集分析，從而提供富集分析結(jié)果的P和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)[15]。本研究為了闡釋紅花如意丸的靶點(diǎn)蛋白在基因功能中的作用，利用在線David 6.8數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov)對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，通過Cytoscape 3.6.1軟件(https：//cytoscape.org)對KEGG通路富集分析中篩選出的信號通路(FDR<0.01)構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

通過篩選，共有73個(gè)化合物符合條件，作為候選化合物，見表1。

2.2 紅花如意丸“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

紅花如意丸“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖1，共包括172個(gè)節(jié)點(diǎn)(73個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，99個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))和625條邊，其中，內(nèi)部的圓形、正方形節(jié)點(diǎn)代表化合物分子，外部3圈的圓形、正方形節(jié)點(diǎn)代表藥物靶點(diǎn)；節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)相連的邊的條數(shù)，度值≥20的節(jié)點(diǎn)表示為四邊形；每條邊則表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，揭示了紅花如意丸的潛在藥理學(xué)作用機(jī)制。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選度值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，這些度值較大的化合物和靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐的作用，可能是關(guān)鍵的化合物、靶點(diǎn)。表2列出了度值排序居前10位的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)(度值≥20)。紅花如意丸“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的平均度值為7.3，其中有7個(gè)靶點(diǎn)可與20個(gè)及以上化合物間有著相互作用的關(guān)系，有6個(gè)化合物可與20個(gè)及以上靶點(diǎn)有著相互作用的關(guān)系，這體現(xiàn)出了紅花如意丸多成分、多靶點(diǎn)間共同作用的藥理學(xué)機(jī)制?！盎衔?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中，度值≥20的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1(prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1)、熱休克蛋白90(heat shock protein HSP 90，HSP90)、雌激素受體(estrogen receptor，ESR1)、鈉通道蛋白5型亞基α(sodium channel protein type 5 subunit alpha，SCN5A)、β2腎上腺素能受體(beta-2 adrenergic receptor，ADRB2)；度值≥20的關(guān)鍵化合物包括：槲皮素(quercetin，M062)、山柰酚(kaempferol，M050)、(-)-維斯體素[(-)-Vestitol，M001]、木犀草素(luteolin，M052)、(R)-(6-甲氧基-4喹啉基)-[(2R，4R，5S)-5-乙烯基奎寧環(huán)-2-基]甲醇{(R)-(6-methoxy-4-quinolyl)-[(2R，4R，5S)-5-vinylquinu-clidin-2-yl]methanol，M011}和異鼠李素(isorhamnetin，M049)。其中，PTGS2的度值最高，可與48個(gè)化合物發(fā)生相互作用的關(guān)系，其次為PTGS1，可與40個(gè)化合物發(fā)生相互作用的關(guān)系；化合物中度值最高的為M062，能與43個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用的關(guān)系，其次為M050，能與28個(gè)靶點(diǎn)發(fā)生相互作用的關(guān)系。

表1 紅花如意丸中含有的73個(gè)活性化合物的基本信息Tab 1 General information of 73 active compounds of Safflower Ruyi pills

表1(續(xù))

編號化合物名稱來源中藥來源數(shù)據(jù)庫M063谷甾醇“sitosterol”降香TCMSPM0646-羥基-4-(3-羥基苯基)-7-甲氧基香豆素“Stevein”降香TCMSPM065豆甾醇“Stigmasterol”紅花TCMSPM066丁香酸“syringic acid”藏木香CNKIM067?；悄懰帷癟aurocholic acid”熊膽TDTM068?；侨パ跄懰帷癟aurodeoxycholic acid”熊膽TDTM069熊果酸“Ursolic acid”熊膽TDTM070“Vestitone”降香TCMSPM071“violanone”降香TCMSPM072異黃酮B“Xenognosin B”降香TCMSPM073甜菜堿“Sativanone”降香TCMSP

圖1 紅花如意丸的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Compound-target network of Safflower Ruyi pills

2.3 紅花如意丸“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

紅花如意丸“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖2，共包括141個(gè)節(jié)點(diǎn)(99個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，42個(gè)疾病節(jié)點(diǎn))和 199條邊，其中，外部的2圈節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，內(nèi)部的節(jié)點(diǎn)表示疾??；度值≥4的節(jié)點(diǎn)表示為三角形；每條邊表示靶點(diǎn)與疾病之間的相互作用關(guān)系，體現(xiàn)出了紅花如意丸多靶點(diǎn)、多疾病的復(fù)雜作用特點(diǎn)。在“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中，PTGS2參與調(diào)節(jié)了痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和乳腺癌等多種疾??；PTGS1參與調(diào)節(jié)了痛經(jīng)、痛風(fēng)和慢性炎癥性疾病等。為了更好地研究紅花如意丸的治療疾病的作用機(jī)制，本研究篩選出了度值排序居前10位(度值≥4)的疾病，見表3。其中，非特異性惡性腫瘤的度值最高，其次是惡性腫瘤，然后類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、乳腺癌和阿爾茨海默病并列第3位。由此推測，出紅花如意丸能在上述疾病的治療過程中發(fā)揮一定的作用，值得深入研究。

表2 紅花如意丸“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)(度值≥20)Tab 2 Topology characteristics of hub nodes from compound-target network of Safflower Ruyi pills (Degree≥20)

2.4 紅花如意丸“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

紅花如意丸“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)見圖3，共包括224個(gè)節(jié)點(diǎn)(10個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)，73個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，99個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，42個(gè)疾病節(jié)點(diǎn))和906條邊；圖中，上面部分中的菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物、上面部分中的三角形節(jié)點(diǎn)代表疾病，左下部分的節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，右下部分的節(jié)點(diǎn)代表化合物，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度值成正比關(guān)系。該圖體現(xiàn)出了紅花如意丸多成分、多靶點(diǎn)和多疾病的復(fù)雜作用特點(diǎn)。例如，降香與31個(gè)化合物、39個(gè)靶點(diǎn)和33個(gè)疾病有相互作用的關(guān)系。表4列出了度值排序居前10位(度值≥24)的關(guān)鍵藥物、化合物、靶點(diǎn)和疾病節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。其中，藥物、化合物、靶點(diǎn)和疾病度值最高的節(jié)點(diǎn)分別為降香、槲皮素、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2和非特異性惡性腫瘤。

2.5 紅花如意丸靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

為了更好地理解紅花如意丸的作用機(jī)制，利用String在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了紅花如意丸潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。PPI網(wǎng)絡(luò)中包括97個(gè)節(jié)點(diǎn)，426條邊；節(jié)點(diǎn)表示蛋白，每條邊代表蛋白與蛋白之間相互作用的關(guān)系。其中，關(guān)鍵蛋白節(jié)點(diǎn)有腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor ap-1，JUN)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKTI)和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亞基γ同種型(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma isoform，PIK3CG)等。靶點(diǎn)蛋白TP53(度值=40)的度值最高，說明其在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著關(guān)鍵作用，是與其他蛋白節(jié)點(diǎn)鏈接的重要橋梁。

圖2 紅花如意丸“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Target-disease network of Safflower Ruyi pills

節(jié)點(diǎn)名稱類別介數(shù)度值非特異性癌癥“Cancer,unspecific”疾病0.188 177 1518前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2“PTGS2”靶點(diǎn)0.368 546 7914惡性腫瘤“Cancer”疾病0.130 550 5313類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎“Rheumatoid arthritis”疾病0.188 141 8511乳腺癌“Breast cancer”疾病0.142 734 4311阿爾茨海默病“Alzheimers Disease”疾病0.112 813 1211疼痛“Pain”疾病0.101 790 0810精神分裂癥“Schizophrenia”疾病0.207 793 2410血栓栓塞癥“Thromboembolism”疾病0.097 676 788鎮(zhèn)痛藥“Analgesics”疾病0.053 032 478焦慮癥“Anxiety disorder”疾病0.068 141 428炎癥“Inflammation”疾病0.129 396 808痛經(jīng)“Dysmenorrhea”疾病0.077 178 247雌激素受體“ESR1”靶點(diǎn)0.081 703 9065-羥色胺2 A受體“HTR2A”靶點(diǎn)0.091 761 366痛風(fēng)“Gout”疾病0.048 769 656骨關(guān)節(jié)炎“Osteoarthritis”疾病0.041 121 886抑郁癥“Depression”疾病0.060 578 606神經(jīng)系統(tǒng)疾病“Neurological diseases”疾病0.079 798 816神經(jīng)元乙酰膽堿受體蛋白,α-7鏈“CHRNA7”靶點(diǎn)0.096 999 795細(xì)胞色素P450 1A2 “CYP1A2”靶點(diǎn)0.111 548 195多巴胺受體D2“DRD2”靶點(diǎn)0.082 458 745孕激素受體“PGR”靶點(diǎn)0.023 426 774絲裂原活化蛋白激酶14“MAPK14”靶點(diǎn)0.063 218 124偏頭痛“Migraine”疾病0.047 748 084卵巢癌“Ovarian cancer”疾病0.020 572 134聚[ADP-核糖]聚合酶“1PARP1”靶點(diǎn)0.034 224 704

圖3 紅花如意丸“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 TCM-compound-target-disease network of Safflower Ruyi pills

節(jié)點(diǎn)名稱類別介數(shù)度值前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)“Prostaglandin G/H synthase 2”靶點(diǎn)0.220 993 9363槲皮素(M062)“quercetin”化合物0.197 577 5947前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1(PTGS1)“prostaglandin G/H synthase 1”靶點(diǎn)0.058 649 9243熱休克蛋白90(HSP90)“heat shock protein HSP 90”靶點(diǎn)0.067 693 2341雌激素受體(ESR1)“estrogen receptor”靶點(diǎn)0.050 633 7233山柰酚(M050)“kaempferol”化合物0.084 879 0632降香“Dalbergiae Odoriferae Lignum”中藥0.019 979 0731鈉通道蛋白5型亞基α(SCN5A)“sodium channel protein type 5 subunit alpha”靶點(diǎn)0.022 461 3428(-)-維斯體素(M001)“(-)-Vestitol”化合物0.031 920 0424β2腎上腺素能受體(ADRB2)“beta-2 adrenergic receptor”靶點(diǎn)0.026 359 9524

圖4 紅花如意丸相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig 4 PPI network of Safflower Ruyi pills related targets

2.6 GO富集與KEGG通路富集分析

利用在線David 6.8數(shù)據(jù)庫平臺的GO和PATHWAY富集分析功能，對紅花如意丸PPI網(wǎng)絡(luò)中所包含的97個(gè)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行GO富集與KEGG通路富集分析。(1)GO富集分析中，共查詢到486個(gè)條目，根據(jù)FDR<0.01，確定了37個(gè)條目，見表5、圖5。其中，生物過程相關(guān)的條目有22個(gè)，涉及質(zhì)膜、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶結(jié)合、氧化還原過程、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)、藥物結(jié)合、突觸和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等方面；細(xì)胞組成相關(guān)的條目有8個(gè)，涉及細(xì)胞外空間、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、突觸和對有毒物質(zhì)的反應(yīng)等方面；分子功能相關(guān)的條目有7個(gè)，涉及質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、相同的蛋白結(jié)合激活MAPK活性等方面。(2)KEGG通路富集分析中，共查詢到107個(gè)通路，根據(jù)FDR<0.01篩選到14個(gè)通路，見表6、圖6(外部3圈的圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，內(nèi)部2圈的六邊形節(jié)點(diǎn)代表通路，節(jié)點(diǎn)的大小與節(jié)點(diǎn)的度成正比例關(guān)系)。圖7是對紅花如意丸關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析的氣泡圖，Y軸表示靶基因顯著富集的KEGG途徑，X軸表示通路中靶基因的數(shù)目；富集因子代表屬于該通路的靶基因數(shù)量與位于該通路中所有注釋基因數(shù)量的比值，富集因子越大，代表富集程度越高；點(diǎn)的大小表示通路中的靶基因數(shù)量，且點(diǎn)的顏色深淺反映了不同的P范圍。所篩選到的通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、TNF信號通路、惡性腫瘤的途徑、前列腺癌信號通路、雌激素信號通路、胰腺癌信號通路、鈣信號通路、鞘脂信號通路、催乳素信號通路和子宮內(nèi)膜癌信號通路等，故推測紅花如意丸的有效成分可能通過作用于上述通路來達(dá)到治療疾病的目的。

圖5 GO條目在生物過程、分子功能、細(xì)胞組成上的分布(FDR<0.01)Fig 5 Distribution of GO terms in biological process, molecular function and cellular component (FDR<0.01)

圖6 紅花如意丸“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)(FDR<0.01)Fig 6 Target-pathway network of of Safflower Ruyi pills (FDR<0.01)

圖7 紅花如意丸關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG分析Fig 7 KEGG analysis for the major targets of Safflower Ruyi pills

3 討論

紅花如意丸具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、調(diào)經(jīng)血和祛斑的功效，臨床上主要用于治療婦科疾病，如血癥、子宮內(nèi)膜異位癥、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)及慢性盆腔炎等。為了更好地探究紅花如意丸的作用機(jī)制，本研究依托網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在明確紅花如意丸主要組方藥物所含有效成分的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-疾病”和“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，分析了化合物與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與疾病以及藥物之間的相互作用關(guān)系，為闡釋紅花如意丸的“多組分-多靶點(diǎn)-多疾病”的治療機(jī)制提供了參考。紅花如意丸的“化合物-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖中所涉及到的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括PTGS2、PTGS1、HSP90、ESR1和TNF等，上述靶點(diǎn)參與調(diào)控的疾病主要包括痛經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、關(guān)節(jié)炎、乳腺癌和慢性盆腔炎等。

PTGS是一種花生四烯酸合成前列腺素類物質(zhì)的關(guān)鍵性限速酶，包括PTGS1、PTGS2等2種異構(gòu)酶。PTGS及其產(chǎn)物參與機(jī)體的血壓調(diào)節(jié)、凝血平衡和炎癥反應(yīng)等多種生理病理過程[16]。生成前列腺素的關(guān)鍵酶PTGS2又稱為環(huán)氧酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)，COX-2在多數(shù)情況下處于靜息或低表達(dá)狀態(tài)，故在細(xì)胞靜息時(shí)或正常生理狀態(tài)下會檢測不到其表達(dá)，其只在病理情況下才會表達(dá)，如當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)等刺激因素的影響時(shí)，PTGS2的表達(dá)增加，迅速在轉(zhuǎn)錄水平上被誘導(dǎo)上調(diào)，使花生四烯酸被催化產(chǎn)生多種前列腺素，導(dǎo)致疼痛和炎癥反應(yīng)。COX-2參與月經(jīng)的發(fā)生，月經(jīng)前期，子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞COX-2表達(dá)增加并催化合成前列腺素，子宮肌層受到刺激而收縮，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜功能層的螺旋小動(dòng)脈發(fā)生持續(xù)痙攣現(xiàn)象，使子宮內(nèi)膜血流減少，組織變性壞死，發(fā)生月經(jīng)。若COX-2的表達(dá)過高，則會引起子宮肌層持續(xù)收縮，發(fā)生痛經(jīng)[17-21]。由此可見，紅花如意丸對PTGS的調(diào)控可能在治療痛經(jīng)的過程中發(fā)揮著重要的作用。

表5 紅花如意丸PPI網(wǎng)絡(luò)中的GO條目(FDR<0.01)Tab 5 List of GO enrichment results to genes in PPI network of of Safflower Ruyi pills (FDR<0.01)

表6 紅花如意丸PPI網(wǎng)絡(luò)中的通路(FDR<0.01)Tab 6 List of pathway enrichment results to genes in PPI network of Safflower Ruyi pills (FDR<0.01)

HSP90是HSP家族的重要成員之一，其在人體中主要有HSP90ɑ、HSP90β等5種亞型，在腫瘤細(xì)胞的生長和存活的調(diào)節(jié)中起著重要作用[22]。HSP90ɑ作為關(guān)鍵的伴侶蛋白，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長與凋亡，還可以通過刺激腫瘤組織的新生血管生長和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)等機(jī)制，最終刺激腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清中HSP90ɑ水平明顯高于乳腺良性腫塊組、健康對照組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)[23]。由此可見，對HSP90的調(diào)控在治療乳腺癌中起著重要作用，使用紅花如意丸治療乳腺癌的作用機(jī)制值得深入研究。有研究結(jié)果表明，臨床中婦科疾病如月經(jīng)失調(diào)、痛經(jīng)和子宮內(nèi)膜異位癥等的發(fā)生多與體內(nèi)雌激素、孕激素水平異常有關(guān)[24]。

ESR1為關(guān)鍵的抑癌基因之一，其編碼的雌激素受體ɑ(ERɑ)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控雌激素水平，ERɑ主要分布于子宮、乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和骨組織等有雌激素效應(yīng)的組織[15，25]。與ERɑ密切相關(guān)的疾病包括乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、骨質(zhì)疏松癥和阿爾茨海默病等[26]。由此可見，紅花如意丸對ESR1的調(diào)控可能在痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)、乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥等疾病的治療過程中發(fā)揮著重要的作用。

TNF包括TNF-ɑ、TNF-β，其可作為腹腔粘連的標(biāo)志物，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等，當(dāng)出現(xiàn)慢性炎癥時(shí)，TNF水平升高[27-28]。由此可見，紅花如意丸對TNF的調(diào)控可能在慢性盆腔炎的治療過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，紅花如意丸治療慢性盆腔疼痛具有良好的臨床療效，且止痛效果優(yōu)于宮炎平膠囊[29]；紅花如意丸在改善女性骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床癥狀方面具有較好的臨床療效[30]；紅花如意丸治療月經(jīng)不調(diào)有著很好的臨床療效[31]；紅花如意丸不僅可以減輕免疫損傷，還可以進(jìn)一步減輕子宮附件炎患者的癥狀，為臨床治療子宮附件炎提供了治療靶點(diǎn)(TNF-ɑ)[3]；紅花如意丸與秦氏風(fēng)濕靈聯(lián)合應(yīng)用，能夠緩解女性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)患者的臨床癥狀，改善膝關(guān)節(jié)功能，減輕炎癥反應(yīng)，提高臨床療效[32]。

本研究對紅花如意丸的靶點(diǎn)進(jìn)行了PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，對其進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與復(fù)雜疾病相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括TP53、JUN等。TP53是關(guān)鍵的抑癌基因之一，當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，其抑癌基因功能喪失，與ras、c-myc等癌基因協(xié)同作用，使正常細(xì)胞發(fā)生瘤化，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[33]。JUN是細(xì)胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其編碼的蛋白產(chǎn)物分別構(gòu)成了Jun家族(c-Jun、Jun B和Jun D)蛋白和Fos家族(c-Fos、Fos B、Foral和Fraz)蛋白；c-Jun蛋白是JUN的主要組成部分，其位于腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，在異位內(nèi)膜中呈高表達(dá)[34]。由此可見，調(diào)節(jié)JUN的表達(dá)對子宮內(nèi)膜異位癥的治療可能有著重要的作用。

為了說明紅花如意丸作用靶點(diǎn)在基因功能和信號通路中的作用，本研究對PPI網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的基因進(jìn)行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析結(jié)果顯示，紅花如意丸治療多種疾病的基因功能主要體現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程的負(fù)調(diào)節(jié)和酶結(jié)合等方面。KEGG通路富集分析中篩選了14條通路，其中，與信號通路相關(guān)的通路有5條，包括TNF信號通路、雌激素信號通路、鈣信號通路、鞘脂信號通路和催乳素信號通路；與疾病相關(guān)的通路有7條，包括結(jié)直腸癌、惡性腫瘤的通路、前列腺癌、胰腺癌、乙型肝炎、子宮內(nèi)膜癌和查加斯病(美洲錐蟲病)，其中5條與惡性腫瘤相關(guān)；與信號分子及相互作用密切相關(guān)的通路有2條，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸通路?；蚋患瘮?shù)排序居前2位的通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用、惡性腫瘤的通路。因此，推測紅花如意丸可能在精神疾病、內(nèi)分泌疾病及多種腫瘤的治療過程中發(fā)揮一定的作用，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對紅花如意丸的多成分、多靶點(diǎn)與多種疾病間復(fù)雜的關(guān)系進(jìn)行了研究。研究結(jié)果初步闡釋了紅花如意丸治療婦科疾病的相關(guān)作用機(jī)制，并為進(jìn)一步深入探討其機(jī)制提供了良好的基礎(chǔ)和參考依據(jù)。