一株高效解磷假單胞菌的分離鑒定及解磷特性

劉希旻，楊海霞，黃靈曦，李曉雁，權(quán)桂芝，楊紅澎，黃海東,通信作者

一株高效解磷假單胞菌的分離鑒定及解磷特性

劉希旻1，楊海霞1，黃靈曦1，李曉雁2，權(quán)桂芝1，楊紅澎1，黃海東1,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

磷是植物生長所必需的重要元素之一，土壤中的磷大都以難溶性磷的形式存在，難以被植物吸收利用。為提高鹽堿地中磷的利用率，從天津濱海新區(qū)鹽堿地土壤中篩選解磷細菌，在無機磷固體平板上分離得到一株能產(chǎn)生明顯溶磷圈的菌株LQH-7，其溶磷指數(shù)為2.86，形態(tài)學(xué)、生理生化和基于16S rDNA基因序列的分子鑒定結(jié)果表明，LQH-7為維羅尼假單胞菌，與CIP 104663的同源性為99.65%。在初始pH為8.0，NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%的無機磷培養(yǎng)基中，30 ℃搖瓶發(fā)酵60 h，菌株LQH-7發(fā)酵液的pH為4.30，解磷量最高可達850.1 mg/L，說明該菌株在鹽堿地土壤生物修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價值。

解磷菌；維羅尼假單胞菌；菌種鑒定；解磷能力

磷是植物生長不可缺少的元素，參與細胞代謝和能量傳遞，缺磷易造成植物生長緩慢、成熟延遲和產(chǎn)量降低[1]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中以施用化肥來增加土壤中的有效磷含量，但磷肥在土壤中的利用率很低，大量磷元素會轉(zhuǎn)化為難溶性的磷酸鹽而被土壤固定，造成土壤的潛在磷庫很大，卻仍然表現(xiàn)出“遺傳學(xué)缺磷”[2]。解磷菌能將被土壤固定的難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物可利用的有效磷[3-4]，在農(nóng)田中施用含有解磷菌的菌肥，在不增加土壤磷庫的情況下，可提供更多的磷元素供作物生長，解磷菌還能在作物根際周圍快速繁殖，抑制其他病原微生物的生長，減輕作物病害[5]。國內(nèi)外研究者對解磷菌進行了大量研究，篩選到的解磷菌包括芽孢桿菌屬（）、假單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）、無色桿菌屬（）、節(jié)桿菌屬（）等的一些菌株[6-9]，這些解磷菌大多從普通土壤中篩選得到，對環(huán)境的適應(yīng)范圍有限，將解磷菌開發(fā)為菌肥就需要篩選適應(yīng)不同土壤類型和溫度條件的微生物[10-11]。本研究中將從鹽堿地土壤中分離得到的一株高效解磷菌LQH-7進行分類鑒定，研究其解磷特性，以期為今后制作微生物菌劑提供菌種資源，并為解決鹽堿地土壤固磷強度高的問題以及提高鹽堿地作物產(chǎn)量提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣采自天津市濱海新區(qū)鹽堿地土壤，北緯39°4'57"，東經(jīng)117°42'8"。

細菌基因組DNA提取試劑盒、酶、質(zhì)粒提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、pGM-T克隆試劑盒均購自北京天根公司，鉬酸銨、丙酮酸鈉、冰乙酸、抗壞血酸均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

無機磷培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，硫酸銨0.5，酵母浸粉0.5，氯化鈉0.3，氯化鉀0.3，硫酸鎂0.3，硫酸亞鐵0.03，硫酸錳0.03，磷酸鈣5，瓊脂15，pH 9.0±0.2。

R2A培養(yǎng)基（g/L）：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酸水解酪素0.5，磷酸氫二鉀0.3，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，瓊脂15，pH 8.0±0.2。

LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 0.5，瓊脂15，pH 7.0～7.5。

1.3 方法

1.3.1 解磷菌的篩選

取10 g土樣，加90 mL無菌水渦旋振蕩10 min，靜置5 min后將上層懸液進行倍比稀釋，取100 μL涂布于添加磷酸鈣的無機磷培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察解磷圈。溶磷指數(shù)（SPI, soluble phosphorus index）＝（菌落直徑＋解磷圈直徑）/菌落直徑。篩選SPI大的菌落進行分離純化，并保存于-80 ℃冰箱中。

1.3.2 菌種鑒定

1.3.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征測定

菌株的形態(tài)學(xué)觀察及接觸酶、脲酶、七葉苷水解、熒光色素和甲基紅試驗等生理生化指標的測定參考文獻[12]進行。

1.3.2.2 菌株的16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)進化分析

利用細菌DNA提取試劑盒提取試驗菌株的基因組DNA，采用細菌16S rDNA基因擴增通用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增， 95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，與pGM-T載體連接后，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞中，在含 IPTG和X-Gal的LB平板上37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌落，驗證并送上海生工進行測序。將得到的16S rDNA序列與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行BLAST比對，得到與其同源性較高的相關(guān)序列，用軟件ClustalX 1.8對所獲得的核苷酸序列進行分析，得到序列之間的相似值；利用軟件 MEGA 2.0計算出序列的系統(tǒng)進化距離，用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[13]。

1.3.3 可溶性磷含量的測定

取1.0 mL發(fā)酵液，于4 ℃，10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至合適倍數(shù)，用鉬藍比色法測定可溶性磷含量[14]，計算公式為：＝×15.91×。式中為發(fā)酵液中可溶磷含量（mg/L），為稀釋倍數(shù)，為660 nm處吸光度值。

1.3.4 菌株LQH-7生長曲線及溶磷能力測定

取活化的菌株LQH-7接種于裝有100 mL無機磷液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于搖床中30 ℃，150 r/min培養(yǎng)84 h，以不接種的培養(yǎng)基為對照，每隔12 h無菌取樣，測定細胞濃度、pH值和可溶磷含量，每個樣品3個重復(fù)。

1.3.5 菌株LQH-7最適溶磷pH的確定

調(diào)節(jié)無機磷液體培養(yǎng)基的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，接種菌株LQH-7，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)60 h后測定細胞濃度、pH值和可溶磷含量，每個樣品3次重復(fù)。

1.3.6 菌株LQH-7最適溶磷鹽質(zhì)量分數(shù)的確定

將菌株LQH-7分別接種于NaCl質(zhì)量分數(shù)為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% pH為8.0的無機磷液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)60 h后，測定細胞濃度、pH值和可溶磷含量，每個樣品3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的篩選

取天津市濱海新區(qū)鹽堿地土壤，用無機磷固體培養(yǎng)基平板進行解磷菌的分離篩選，得到1株能產(chǎn)生明顯溶磷圈的細菌，其溶磷指數(shù)（SPI）為2.86（圖1），將該菌株命名為LQH-7，并對其進行分類鑒定和解磷特性研究。

圖1 菌株LQH-7的溶磷圈

2.2 菌株LQH-7的分類鑒定

2.2.1 菌株LQH-7的形態(tài)特征

在R2A平板培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2 d，菌株LQH-7形成邊緣整齊的白色菌落，表面光滑，凸起，直徑4.5～5.0 mm。菌株LQH-7的細胞大小為（0.6～0.8）μm ×（2.0～3.5）μm，桿狀（圖2）、無芽孢、革蘭氏陰性。

圖2 菌株LQH-7的細胞形態(tài)（×1 000）

2.2.2 菌株LQH-7的16S rDNA序列測定及系統(tǒng)進化分析

擴增得到菌株LQH-7的16S rDNA序列，長度為1 422 bp，在GenBank中的序列登記號為MK734421。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，得到與其同源性高的序列信息，進而進行ClustalX1.8比對，并利用軟件MEGA 2.0的鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)果表明，菌株LQH-7屬于屬，與劃分在同一個簇內(nèi)，同源性最高的為

CIP 104663，達到99.65%，與CCM 2115同源性為99.02%，與ATCC 10844同源性為98.87%，根據(jù)目前的分子分類標準，判斷菌株LQH-7為（維羅尼假單胞菌）。

圖3 菌株LQH-7的16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹

2.2.3 菌株LQH-7的生理生化特征

菌株LQH-7的生長溫度范圍為4～39 ℃。由表1可知，該菌株產(chǎn)熒光色素，石蕊牛奶試驗表現(xiàn)為酸凝現(xiàn)象，接觸酶、淀粉酶、脲酶、酪蛋白水解、V-P試驗、檸檬酸利用和吲哚產(chǎn)生為陽性；酯酶、甲基紅試驗、七葉苷水解呈陰性；與模式菌株CIP 104663在酯酶等指標上不同[15]。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和基于16S rDNA的分子分類數(shù)據(jù)，確定菌株LQH-7為維羅尼假單胞菌，是與該種模式菌株不同的菌株。

表1 菌株LQH-7的生理生化特征

項目結(jié)果項目結(jié)果 接觸酶＋V-P試驗＋ 酯酶-淀粉酶＋ 檸檬酸鹽利用＋吲哚產(chǎn)生＋ 甲基紅試驗-七葉苷水解- 酪蛋白水解＋石蕊牛奶酸凝 熒光色素＋脲酶＋

2.3 培養(yǎng)時間對菌株LQH-7解磷量的影響

由圖4可知，菌株LQH-7在發(fā)酵培養(yǎng)36 h后達到最高菌量，細胞濃度為4.2×109cfu/mL，隨著培養(yǎng)時間的延長，LQH-7培養(yǎng)液的pH也隨之逐漸降低，培養(yǎng)60 h時，pH為4.67，此時解磷量最高，培養(yǎng)液中的可溶磷含量達到831.4 mg/L。60 h后培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在4.50左右，由于細胞代謝活力的降低，菌株的溶磷量開始下降。

圖4 培養(yǎng)時間對菌株LQH-7解磷量的影響

2.4 pH對菌株LQH-7解磷量的影響

在初始pH為4.0～11.0的培養(yǎng)基中進行LQH-7的發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，pH在5.0～8.0 范圍內(nèi)，培養(yǎng)60 h后細胞濃度均處在較高水平，在3.6×109cfu/mL以上。但更高的初始pH影響細胞的生長，且發(fā)酵液的最終pH上升，解磷量隨之下降。初始pH為8.0時，解磷量最高，比初始pH 7.0時的解磷量高9.4%，最終發(fā)酵液pH值為4.36。說明篩選得到的解磷菌LQH-7具有一定的耐堿性。

圖5 初始pH對菌株LQH-7解磷量的影響

2.5 NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株LQH-7解磷量的影響

菌株LQH-7的耐鹽試驗結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，LQH-7解磷效果最佳時的NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%，此條件下的細胞濃度最高，為6.1×109cfu/mL，發(fā)酵液pH為4.30，可溶磷含量也達到最高，為850.1 mg/L。LQH-7細胞生長可以耐受的NaCl質(zhì)量分數(shù)為2.5%，在鹽質(zhì)量分數(shù)為0～2.5%的條件下，LQH-7發(fā)酵液的最終pH均低于5.91，解磷量高于202.1 mg/L。當NaCl質(zhì)量分數(shù)為3.0%時，菌株LQH-7的生長和解磷能力均被抑制，發(fā)酵液最終pH為6.40，細胞濃度和可溶磷含量分別為最高值的7.6%和14.9%。

圖6 NaCl質(zhì)量分數(shù)對菌株LQH-7解磷量的影響

3 結(jié)論

我國鹽堿地總面積達9 913萬hm2，約占全國土地面積的1/10[16]。磷元素利用率低是制約作物生長的主要因素之一。研究表明，解磷菌能夠通過產(chǎn)生有機酸，釋放土壤中固定的磷，為作物生長提供可利用的有效磷，同時降低作物根際的pH，增加作物的耐堿性[17]。假單胞菌是植物根系中較為活躍的一類解磷微生物，用作生物肥料可提高土壤中磷的利用率，增加作物產(chǎn)量。如，，，等對玉米、小麥、黃瓜、番茄都有較好的促生作用[18]，而維羅尼假單胞菌的相關(guān)研究尚未見報道。

本研究從天津市濱海新區(qū)鹽堿土壤中篩選到一株高效解磷菌LQH-7，多項分類鑒定結(jié)果表明其為維羅尼假單胞菌（），在初始pH為8.0，NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.5%的條件下，解磷量可達850.1 mg/L，與國內(nèi)外報道的一些高效解磷菌株P(guān)S-1[19]，P9[20]，RAF15[21]相比，LQH-7具有較高的解磷能力，且能適應(yīng)中度鹽漬化的土壤，說明篩選到的菌株在鹽堿地生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用潛力，對菌株LQH-7進行深入研究，可為適用于鹽堿地的微生物肥料研發(fā)提供新的菌種資源。

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Isolation and identification of a high-efficiency phosphate solubilizingand its phosphate solubilizing characteristics

LIU Xi-min1, YANG Hai-xia1, HUANG Ling-xi1, LI Xiao-yan2, QUAN Gui-zhi1,YANG Hong-peng1, HUANG Hai-dong1, Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resources Environmentt, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

Phosphorus is one of the important elements for plant growth. Plants cannot absorb enough phosphorus when a large amount of phosphorus in the soil exists in the form of insoluble state. To increase the utilization efficiency of phosphorus in saline-alkali, phosphate solubilizing bacteria were isolated from saline-alkali soil in Binhai New Area of Tianjin. Strain LQH-7, producing distinct soluble phosphorus circle with SPI 2.86, was isolated in inorganic phosphorus solid plate. Morphology, physiological-biochemical index and phylogenetic analysis based on 16S rDNA gene sequences showed that strain LQH-7 belonged to, exhibiting the highest sequence similarity withCIP 104663（99.65%）. In inorganic phosphorus medium，under the fermentation conditions in which the initial pH was 8.0, NaCl content was 0.5%, temperature was 30 ℃ and fermentation time was 60 h, pH of strain LQH-7 fermentation broth reached 4.30 and the phosphate-solubilizing quantity reached its highest value, 850.1 mg/L, suggesting that LQH-7 is a potent candidate for bioremediation of saline-alkali soil.

phosphate solubilizing bacteria;; identification of bacteria; phosphate solubilizing ability

1008-5394（2019）04-0049-05

10.19640/j.cnki.jtau.2019.04.010

S154.38

A

2019-06-27

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201910061002）

劉希旻（1998-），男，本科在讀，研究方向：生物技術(shù)。E-mail：XmLiu19980119@163.com。

黃海東（1972-），男，教授，博士，研究方向：資源與應(yīng)用微生物學(xué)。E-mail：hdhuang@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：宗淑萍