芪榆膏紗條外敷對(duì)肛瘺切除術(shù)后創(chuàng)面PCNA表達(dá)的影響

曹 波，盧 丹，李 志，劉 訪，董聿錕，夏佳毅

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550001）

目前肛瘺的主要治療方法仍是以手術(shù)為主，手術(shù)有切除、掛線等方法[1]。肛瘺術(shù)后換藥均存在一定的難度，而對(duì)于該類傷口的處理，關(guān)鍵在于防止創(chuàng)面基底過早愈合或形成假愈合，故不僅應(yīng)保證在換藥時(shí)充分暴露創(chuàng)面、及時(shí)清除引流出的分泌物，而且還需在創(chuàng)面基底部填塞紗條，使創(chuàng)面不至過早粘合而形成橋型愈合。因此，創(chuàng)面愈合的快慢取決于肛瘺術(shù)后換藥方法及所用藥物的功效，治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的換藥。本研究觀察了芪榆膏紗條對(duì)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的影響，報(bào)道如下。

1 臨床資料

共60例，均為貴州省肛腸病醫(yī)院接受常規(guī)低位單純性肛瘺切除術(shù)治療的住院患者，隨機(jī)分成治療組和對(duì)照組各30例。治療組男27例，女3例；年齡22～62歲，平均（36.63±11.04）歲；平均病程（17.93±5.17）天，創(chuàng)面縱徑（4.07±0.66）cm，原始創(chuàng)面面積（35.88±6.6）mm2。對(duì)照組男27例，女3例；年齡19～54歲，平均（37.73±12.69）歲；平均病程（19.77±7.18）天，創(chuàng)面縱徑（4.1±0.61）cm，原始創(chuàng)面面積（36.33±6.03）mm2。兩組性別、年齡、病程、創(chuàng)面縱徑、原始創(chuàng)面面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參照經(jīng)2006年珠海中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)肛腸分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)結(jié)直腸肛門外科學(xué)組、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)大腸肛門病專業(yè)委員會(huì)制定的《肛瘺臨床診治指南》，即肛瘺系肛周皮膚與肛管直腸之間的慢性、病理性管道，常于肛門直腸周圍膿腫破潰或切開引流后形成，病灶有外口、管道、內(nèi)口可征，其中低位單純性肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)為：內(nèi)口在肛隱窩，僅僅只有1個(gè)瘺道走行于外括約肌皮下部或淺部并與皮膚相通。

2 治療方法

芪榆膏紗條的制作：黃芪120g、當(dāng)歸尾60g、生地榆60g、乳沒各30g、龍血竭30g、紫草30g、川牛膝30g，各藥均勻混合并研成細(xì)粉，過篩100目，將藥粉納入1000g麻油中浸泡72h，大火燒開麻油后改用文火將各藥炸至藥渣呈棕褐色為度，雙層紗布濾渣，待油溫降至50℃時(shí)，將蜂膠徐徐攪拌均勻備用。換藥時(shí)將芪榆膏均勻涂抹在約5cm×3cm無菌紗條上，厚約1mm。

人工愈合膜紗條制作：換藥時(shí)將人工愈合膜（杭州積好脂質(zhì)體有限公司生產(chǎn)）均勻涂抹在約5cm×3cm無菌紗條上，厚約1mm。

兩組術(shù)前均備皮、清潔灌腸；手術(shù)麻醉方式采用連續(xù)硬膜外阻滯麻醉；手術(shù)方式均采用肛瘺切除術(shù)。用尺子分別測(cè)量低位單純性肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的縱徑，選擇手術(shù)創(chuàng)面縱徑為2～5cm之間的肛瘺納入。術(shù)后兩組均使用同種抗生素、止痛藥、止血藥各3天，其中抗生素用奧硝唑0.5g，靜滴，日2次；止痛藥用氯諾西康8mg，靜滴，日2次；止血藥用氨甲環(huán)酸0.5g，靜滴，日2次。

一般肛瘺術(shù)后控制大便24h。24h內(nèi)排大便者便后換藥，無便意者24h后換藥。兩組換藥時(shí)應(yīng)充分暴露創(chuàng)面，常規(guī)消毒創(chuàng)面及周圍皮膚黏膜，仔細(xì)清除創(chuàng)面上的壞死組織及液化物，再予無菌干棉球擦掉。治療組、對(duì)照組分別將芪榆膏紗條、人工愈合膜紗條均勻填塞至于創(chuàng)面基底部，填塞紗條長(zhǎng)于創(chuàng)面1cm，使之成為口寬底小之形，以無菌紗布敷蓋，并予膠布固定。兩組均每日換藥1次。

3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)術(shù)后創(chuàng)面面積及創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面面積：根據(jù)孫彥輝等[2]測(cè)量創(chuàng)面愈合率的方法，在固定距離15 cm背景上放置1枚1角硬幣（面積為2.83㎝2）并進(jìn)行拍照。于術(shù)后第7天及第14天換藥前分別用透明薄膜覆蓋于創(chuàng)面上，沿創(chuàng)緣描計(jì)創(chuàng)面的大小，取下透明薄膜并展開，用數(shù)碼相機(jī)（Nikon D7000、169萬像素）于固定距離15cm進(jìn)行拍照。采用Photoshop圖像處理軟件，打開使用數(shù)碼相機(jī)拍攝并標(biāo)記的創(chuàng)面圖片，用軟件中“魔棒”或者“磁性套索”工具選取圖片中所標(biāo)記的創(chuàng)面部分，打開菜單中的“圖像”并選取“直方圖”選項(xiàng)，記錄顯示參數(shù)中的“像素”數(shù)值。并用同樣的方法測(cè)量出1角硬幣的像素值，1cm2的像素值=1角硬幣的像素值/2.83。由上述操作即可計(jì)算出創(chuàng)面面積（㎝2）=標(biāo)記的創(chuàng)面部分像素值/1cm2的像素值。（手術(shù)完畢后所測(cè)得創(chuàng)面面積作為原始面積）。

創(chuàng)面愈合率：用藥第6、13天后（即分別為術(shù)后第7、14天）觀測(cè)評(píng)定創(chuàng)面愈合率。參照下列公式[2]：第n天創(chuàng)面愈合率=[（原始創(chuàng)面面積-術(shù)后第n天創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積]×100%。

檢測(cè)PCNA表達(dá)：組織標(biāo)本采集及制備方法[3]。術(shù)后第7、14天換藥時(shí)，在同一時(shí)段使用鑷子刮取創(chuàng)面邊緣約1.0mm×1.0mm的創(chuàng)面組織，放入事先準(zhǔn)備好裝有一定量的PBS，PH7.4的專用Eppendof管中，注意無菌操作，并做好編號(hào)，放于4℃恒溫冰箱中保存，立即送往-80℃液氮冰箱中速凍。待60例標(biāo)本全部收集完畢后全部取出。標(biāo)本融化后仍然保持2℃～8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4）。用勻漿器將標(biāo)本勻漿化，離心20min左右（2000～3000轉(zhuǎn)/min），離心去除沉淀，仔細(xì)收集上清，行ELISA法測(cè)PCNA的表達(dá)。

用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理分析，計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示、用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 治療結(jié)果

兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積比較見表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積比較 （mm2，±s）

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面面積比較 （mm2，±s）

指標(biāo) 治療組 對(duì)照組 t P術(shù)后第7天創(chuàng)面面積 13.32±2.17 16.23±2.55 -4.763 0.000術(shù)后第14天創(chuàng)面面積 5.53±1.26 8.89±1.85 -8.231 0.000

兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較見表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較情況 （%，±s）

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較情況 （%，±s）

指標(biāo) 治療組 對(duì)照組 t P術(shù)后第7天創(chuàng)面愈合率 63.26±2.0954.48±2.27 15.595 0.000術(shù)后第14天創(chuàng)面愈合率 84.74±2.5275.25±1.8 16.800 0.000

兩組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面PCNA表達(dá)比較見表3。

表3 兩組兩組不同時(shí)間點(diǎn)PCNA表達(dá)比較 （數(shù)量每/視野，±s）

表3 兩組兩組不同時(shí)間點(diǎn)PCNA表達(dá)比較 （數(shù)量每/視野，±s）

指標(biāo) 治療組 對(duì)照組 t P術(shù)后第7天PCNA含量 3.54±0.08 2.94±0.06 -2.532 0.000術(shù)后第14天PCNA含量 2.74±0.09 2.40±0.09 -3.735 0.000

5 討 論

中醫(yī)認(rèn)為，肛瘺術(shù)后創(chuàng)傷是由于金刃所傷，雖原病灶已除，但肌膚受損、脈絡(luò)斷裂，致使經(jīng)絡(luò)損傷，經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血運(yùn)行不暢，氣血凝聚；氣血不能傳輸于肌膚、腠理，故使得術(shù)后創(chuàng)面失于榮養(yǎng)，創(chuàng)面纏綿難愈或愈后容易復(fù)發(fā)。傷前雖無陰陽偏性，但長(zhǎng)時(shí)間損其正氣，外邪可乘傷而入，正虛邪盛，不能托毒外出。雖手術(shù)能祛除肛瘺之腐肉，但仍會(huì)有部分殘留，加之漏瘡綿延不愈，術(shù)中受金創(chuàng)，久病必虛、久病必瘀，正虛邪盛，不能托毒外出。因此，肛瘺術(shù)后創(chuàng)面處于“虛”、“瘀”、“腐”、“濕熱”的狀態(tài)，通過術(shù)后換藥解決創(chuàng)面的“虛”、“瘀”、“腐”、“濕熱”問題尤為重要。肛瘺術(shù)后的主要病機(jī)是“氣血虧虛、濕毒蘊(yùn)結(jié)”虛實(shí)夾雜之癥，以氣血虧虛為主，故治宜益氣活血、祛腐生肌為法。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，創(chuàng)面愈合的過程需要經(jīng)歷3個(gè)基本的階段：炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期以及基質(zhì)重建期[4]，這3個(gè)階段將影響到創(chuàng)面的愈合時(shí)間及愈合質(zhì)量[4]。①炎性反應(yīng)期：此期是創(chuàng)傷愈合的初級(jí)階段，包括血小板凝集、纖維蛋白溶解、免疫應(yīng)答反應(yīng)和復(fù)雜的細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)還大量的釋放在創(chuàng)面愈合過程中起重要作用的生長(zhǎng)因子。②細(xì)胞增殖期：實(shí)現(xiàn)受損組織的修護(hù)是通過細(xì)胞（主要有上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等）的遷徙、分化及增殖而實(shí)現(xiàn)的。肉芽組織在創(chuàng)面修護(hù)中具有非常重要的作用，并為上皮組織爬生提供必要的條件。③基質(zhì)重建期：此期成纖維細(xì)胞減少，肉芽組織生成停止并開始退化，局部組織改構(gòu)和重塑，使其轉(zhuǎn)變?yōu)檎＝Y(jié)締組織以形成瘢痕愈合并逐步恢復(fù)功能。

增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）被認(rèn)定為是DNA聚合酶pol δ（polymerase δ）的一種輔助蛋白，與真核細(xì)胞S期的DNA的復(fù)制有關(guān)[5]。當(dāng)處于靜止期的細(xì)胞內(nèi)時(shí)含量較低，而在細(xì)胞分裂周期G1晚期時(shí)，其含量逐漸增加，其中S期的含量達(dá)到高峰，到達(dá)G2、M期后，其含量就明顯降低[6]。研究表明，PCNA不僅可參與DNA的合成與復(fù)制，而且還能夠與多種DNA修復(fù)因子（如XPG、核酸內(nèi)切酶等）相互作用，影響核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair，NER）和錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）[7]。PCNA還與PZI和Gadd45蛋白相結(jié)合，直接參與調(diào)控DNA的修復(fù)[8]，因此，PCNA高表達(dá)可能一方面跟細(xì)胞內(nèi)的DNA快速合成復(fù)制、細(xì)胞迅速分裂有關(guān)；另一方面可確保細(xì)胞在迅速增殖分化時(shí)能將正確的遺傳信息傳遞給子細(xì)胞，不發(fā)生遺傳信息丟失或突變的可能，故在DNA合成復(fù)制時(shí)能對(duì)基因組的穩(wěn)定性和完整性起到保護(hù)與監(jiān)督作用。組織損傷后，創(chuàng)面都需經(jīng)過炎癥反應(yīng)期、細(xì)胞增殖期和基質(zhì)重建期，如果其中某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題將會(huì)引起創(chuàng)面愈合失控，從而導(dǎo)致創(chuàng)面過度增生，形成增生性瘢痕，或創(chuàng)面愈合遲緩，形成慢性難愈性潰瘍。細(xì)胞的增殖和凋亡直接參與和調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中的多個(gè)環(huán)節(jié)并在影響創(chuàng)面預(yù)后的方面起主導(dǎo)作用。創(chuàng)面愈合遲緩的主因可能與由于某些活性修護(hù)細(xì)胞增殖不足或凋亡過度有關(guān)[9]。邢捷等[10]研究補(bǔ)益氣血中藥八珍湯對(duì)大鼠慢性難愈性創(chuàng)面的研究證實(shí)：一方面能明顯增加創(chuàng)面肉芽組織中PCNA的表達(dá)量，促進(jìn)細(xì)胞增殖；另一方面，還能明顯抑制創(chuàng)面肉芽組織細(xì)胞的凋亡，從而加速創(chuàng)面愈合，縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間。

研究結(jié)果顯示，芪榆膏紗條組能使創(chuàng)面在愈合中期增加PCNA表達(dá)并使其達(dá)到高峰，從而加速創(chuàng)面愈合；而在愈合晚期PCNA表達(dá)減少有益于減少創(chuàng)面瘢痕的形成，縮小創(chuàng)面面積，增加其創(chuàng)面愈合率，從而使創(chuàng)面愈合的速度及質(zhì)量發(fā)生顯著變化，加速創(chuàng)面修復(fù)的進(jìn)程。可見芪榆膏紗條影響創(chuàng)面愈合的機(jī)制之一是通過PCNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。