一株巨菌草內(nèi)生生防菌的分離、鑒定及其基因組測序分析

宋昭昭，賈雨雷，黃在興，林標(biāo)聲,3，梅 蘭，林占熺

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；3. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012）

巨菌草(Pennisetum giganteumsp.)屬于禾本科狼尾草屬多年生植物，其分蘗速度快、根系發(fā)達(dá)、葉面積寬[1]，莖粗可達(dá)3.5 cm、株高最高可達(dá)708 cm，適宜在熱帶、亞熱帶栽培，已推廣到巴布亞新幾內(nèi)亞、馬來西亞、盧旺達(dá)、萊索托、南非、埃及及我國福建、廣西和海南等地種植[2]。巨菌草為典型的C4植物，其營養(yǎng)豐富，纖維、粗蛋白、糖分等含量高、適口性好、根系發(fā)達(dá)、生物量大等[2-3]，因此不僅廣泛應(yīng)用于栽培食藥用菌[4]、生態(tài)脆弱區(qū)的治理與修復(fù)[5]，同時(shí)還可用于發(fā)電、生產(chǎn)沼氣及乙醇、造紙等領(lǐng)域[6-8]。是一種具有較強(qiáng)應(yīng)用價(jià)值的能源草、生態(tài)草。

生物防治是使農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一，內(nèi)生菌(Endophyte)作為生防菌是近年來研究的熱點(diǎn)[9]。內(nèi)生菌是寄生在健康植物組織內(nèi)、但不引起植物組織明顯病害癥狀的一類微生物，包括真菌、細(xì)菌、放線菌及古細(xì)菌等多種微生物類群[10]。其作為生防資源在一定程度上可以減少對環(huán)境的污染。內(nèi)生菌對其寄主植物起到生防作用主要通過4個(gè)主要途徑：產(chǎn)生抗生素；競爭生態(tài)位和營養(yǎng)；誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和促進(jìn)植物生長[11]。關(guān)于植物內(nèi)生菌在防治病害、促進(jìn)植物生長發(fā)育、固氮方面等的作用，國內(nèi)外均有一定研究[12]。其中，內(nèi)生鏈霉菌的研究主要集中在水稻(Oryza sativa)、生姜(Zingiber officinale)、牛筋草(Eleusine indica)、檉柳(Tamarix chinensis)、香蕉(Musa paradisiaca)等植物上，但對巨菌草的內(nèi)生菌研究卻鮮有報(bào)道。

玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolaris maydis)是引起禾本科植物玉米小斑病 (Corn southern leaf blight)的一種非專性寄生病原菌。該病菌引起的玉米小斑病是世界玉米種植區(qū)一種重要的葉部病害[13]，玉米小斑病在中國玉米主產(chǎn)區(qū)每年都有不同程度的發(fā)生，個(gè)別年份甚至猖獗流行，可引起玉米(Zea mays)葉片過早干枯，輕者降低千粒重，重者導(dǎo)致果穗腐爛、種子發(fā)黑、發(fā)芽率降低，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[14]。目前，對玉米小斑病的防治主要為化學(xué)防治和選育抗病品種等手段，但效果較差。近年來，隨著綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展，采用內(nèi)生菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢成為了防治玉米小斑病的一個(gè)重要研究方向。

本研究從巨菌草中分離出一株對玉蜀黍平臍蠕孢有抑菌活性的巨菌草內(nèi)生菌，采用Illumina Miseq第二代測序技術(shù)對其基因組序列進(jìn)行測序分析，以期為該菌株的功能基因組學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為深入研究該菌株在生物防治方面的作用及其遺傳多樣性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

在國家菌草工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地采集健康的巨菌草根、莖稈、葉片樣本，樣本采集后立即清洗干凈，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

植物病原菌: 玉蜀黍平臍蠕孢由福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心從多年栽培的巨菌草患病葉片中分離保存，傳代培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(土豆 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH自然)，28 ℃ 培養(yǎng) 3 d。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生拮抗菌株分離

樣品用無菌水沖洗，75%酒精和2%次氯酸鈉分別消毒1和5 min，無菌水沖洗3～5次。每100 mg樣品與1 mL無菌水混合，充分研磨，進(jìn)行10-2，10-3，10-4，10-5濃度梯度稀釋，各取 100 μL 分別涂布于PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 7.2)、高氏一號培養(yǎng)基 (可溶性淀粉 20 g，硝酸鉀 1 g，磷酸氫二鉀 40.5 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，瓊脂 20 g，水 1 L， pH 7.2)上，28 ℃

培養(yǎng)3～5 d，挑取具有不同形態(tài)特征的菌落，經(jīng)多次平板劃線純化后，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對內(nèi)生菌抑菌活性的初篩、復(fù)篩采用對峙法[15]。初篩出優(yōu)良菌株進(jìn)行復(fù)篩，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)處理使用DPS數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2.2 內(nèi)生拮抗菌株的菌株鑒定

形態(tài)特征和培養(yǎng)特征：參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]，利用細(xì)菌微量生化鑒定管對菌株JK7-2進(jìn)行生理生化鑒定。

16S rDNA的序列分析：使用快速無毒DNA提取試劑盒(高提取量型)(福州麥力生物科技有限公司)提取基因組DNA，以此為模板，使用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGG TTACCTTGTTACGACTT-3')通用引物進(jìn)行16S rRNA基因PCR。產(chǎn)物送上海生工測序。利用NCBI (National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nih.gov/BLAST/)搜索其同源基因，采用DNAMAN進(jìn)行序列同源性比對分析，采用MEGA7.0 軟件構(gòu)建 NJ (neighbor joining)分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 內(nèi)生拮抗菌株的基因組測序和分析

使用 MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit按照操作步驟提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop檢測和Qubit檢測DNA質(zhì)量。將純化的基因組DNA經(jīng)Covaris破碎儀隨機(jī)打斷成長度為300 bp小片段，經(jīng)末端修復(fù)和加A尾后在片段兩端連接接頭制備DNA文庫。

庫檢合格后，利用 Illumina HiSeq PE150高通量測序平臺對該生防菌株DNA文庫進(jìn)行進(jìn)行基因組測序。采用spade程序?qū)θコ宇^序列的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接，基因組序列基本評估,對拼接的數(shù)據(jù)進(jìn)行評價(jià)。選取大于200 bp的 scaffold序列進(jìn)行后續(xù)分析。采用Velvet 1.2.10組裝軟件進(jìn)行序列組裝，運(yùn)用原核基因組注釋工具prokka[17]對菌株基因組進(jìn)行注釋，并與GO，COG，KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。其中蛋白編碼基因的GO注釋采用根據(jù)Pfam的結(jié)果通過Pfam2go[18]軟件來完成；蛋白編碼基因的COG的注釋采用blast軟件來完成；蛋白編碼基因的Pathway注釋采用KEGG的KAAS自動化注釋系統(tǒng)完成。通過對蛋白編碼基因進(jìn)行功能注釋和分類，從而獲得菌株基因組功能注釋信息。

2 結(jié)果和分析

2.1 拮抗菌的篩選

從巨菌草根、莖、葉中分離到45株菌株。經(jīng)過復(fù)篩得到10株抑菌率大于10%的菌株(表1)，抑菌效果最好的菌株為JK7-2，抑菌率為28.57%，其發(fā)酵液對玉蜀黍平臍孺孢有強(qiáng)烈的抑制作用(圖 1)。

表 1 內(nèi)生菌對玉蜀黍平臍孺孢的抑菌效果Table 1 Inhibition effect of endophytes to Bipolaris maydi

圖 1 菌株JK7-2發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)Figure 1 Bacteriostasis experiment of strain JK7-2 with fermentation broth

表 2 菌株JK7-2對碳源的利用情況Table 2 Utilization of carbon source by strain JK7-2

2.2 拮抗菌的菌株鑒定

菌株JK7-2在高氏一號培養(yǎng)基上生長豐茂，菌落為淺灰色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，革蘭氏染色為陽性。顯微鏡下觀察，孢子絲直，柔曲，松敞螺旋形。部分生理生化特征鑒定結(jié)果如表2所列，菌株JK7-2能夠利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、半乳糖等碳源，但不能利用乳糖、棉籽糖、甘露醇和木糖等碳源。將本結(jié)果同《鏈霉菌鑒定手冊》上不同種菌株進(jìn)行比對，并結(jié)合JK7-2在培養(yǎng)基上形態(tài)及顯微鏡下觀察結(jié)果，可初步判定為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)。

對JK7-2菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比較，利用軟件MEGA7對菌株JK7-2的16S rDNA序列與同屬的其他菌株的16S rDNA進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)結(jié)果表明，菌株 JK7-2 與菌株Streptomycessp. SIIA 2050位于同一系統(tǒng)發(fā)育分支上，結(jié)合其生理生化特性和培養(yǎng)特征，該菌株屬于鏈霉菌屬的鏈霉菌。

2.3 基因組組裝與注釋

原始測序數(shù)據(jù)結(jié)果表明，菌株JK7-2基因組中有 5 207 939個(gè)原始讀數(shù) (raw reads)，總堿基數(shù)為781 190 850。經(jīng)過序列拼接得到77個(gè)骨架(scaffold)，其中 40個(gè)大于 1 000 bp，GC含量為73.17%，序列長度為 8 818 289 bp。預(yù)測該菌株其編碼 7 432 個(gè)基因，基因總長度為 7 654 773 bp，編碼基因占基因組百分比為86.80%。將測序原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得SRA BioProject Accession(生 物 工 程 ID)： PRJNA451251(alias:ERR1216363)。

2.4 Streptomyces sp. JK7-2蛋白質(zhì)COG聚類分析

基于原核基因組注釋工具 prokka對細(xì)菌基因組進(jìn)行注釋的基因預(yù)測結(jié)果表明，菌株JK7-2共預(yù)測得到7 432個(gè)基因，通過COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對分析(E-value＜1E-10)，成功獲得COG功能注釋的有6 677個(gè)蛋白基因(圖3)。主要為一般功能預(yù)測、轉(zhuǎn)錄相關(guān)、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、氨 基酸運(yùn)輸與代謝、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、次級代謝產(chǎn)物合成等。

圖 2 基于菌株JK7-2及其他鏈霉菌屬菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的NJ進(jìn)化樹Figure 2 NJ evolution tree constructed from strain JK7-2 and other 16S rDNA sequences of Streptomyces strains

圖 3 菌株JK7-2的蛋白質(zhì)COG聚類分析Figure 3 Protein COG cluster analysis of strain JK7-2

將預(yù)測基因的蛋白序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得GO注釋信息，蛋白編碼基因的GO注釋采用根據(jù)Pfam的結(jié)果通過Pfam2go軟件來完成。GO注釋包括基因的分子功能、參與的生物學(xué)過程、所處的細(xì)胞位置。如圖4所示，共有8 758個(gè)基因成功獲得GO功能注釋。在生物學(xué)過程方面，主要與代謝過程(1 434個(gè))、單組織過程、細(xì)胞內(nèi)過程、和定位有關(guān)；在細(xì)胞組分方面，主要與膜(608個(gè))、細(xì)胞(127個(gè))、細(xì)胞部分和細(xì)胞器有關(guān)；在分子功能方面，主要與催化活性(1 817個(gè))、結(jié)合(1 150個(gè))、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性有關(guān)。

2.5 KEGG代謝通路分類

根據(jù)KEGG對該菌株分析得知，菌株基因組共有1 611個(gè)基因得到注釋。糖代謝、氨基酸代謝以及膜運(yùn)輸為菌株基因組最主要涉及的幾種代謝通路，分別有222個(gè)、219個(gè)和133個(gè)基因注釋結(jié)果(圖5)。進(jìn)一步通過KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，菌株JK7-2有354個(gè)與抗生素合成有關(guān)通路得到注釋。此外還發(fā)現(xiàn)20個(gè)鏈霉素和5個(gè)四環(huán)素已及17個(gè)青霉素等抗生素產(chǎn)生通路相關(guān)的基因。

3 討論與結(jié)論

鏈霉菌屬原核生物界放線菌目鏈霉菌科具有絲狀分支菌絲的革蘭氏陽性細(xì)菌[19]，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境及一些生物體內(nèi)[20]。該屬的大多數(shù)成員能產(chǎn)生在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、生物防治等領(lǐng)域具有重要意義的天然次級代謝物[21]。較土壤放線菌而言，植物內(nèi)生放線菌研究較少且所處生境特殊，成為新菌株和天然活性化合物的新來源，在促生、抑制病蟲害等方面具有廣闊應(yīng)用前景[22]。鏈霉菌能利用拮抗作用抑制其他植物病原微生物，其作用機(jī)制一般包括拮抗作用、競爭作用和誘導(dǎo)植物抗性作用等[23]。鏈霉菌可通過產(chǎn)生抗生素等多種活性物質(zhì)，來抑制病原菌的生長和繁殖，在生物防治和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

DNA是生命遺傳信息的載體，但是，遺傳信息和生命功能的體現(xiàn)卻主要由蛋白質(zhì)來完成，因此，蛋白質(zhì)編碼基因的功能注釋是微生物全基因組分析的核心內(nèi)容。通過對蛋白質(zhì)編碼基因的功能進(jìn)行注釋，才能對該物種的生命活動在分子的水平上有所認(rèn)識[24]。本研究采用Illumina HiSeq第二代高通量測序技術(shù)對分離自巨菌草的具有抗病 原真菌特性的鏈霉菌菌株JK7-2進(jìn)行基因組測序，從JK7-2菌株基因功能注釋結(jié)果來看，COG數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄相關(guān)、碳水化合物運(yùn)輸與代謝、氨基酸代謝是菌株主要的功能預(yù)測結(jié)果，值得注意的是，該菌株與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因有349個(gè)，擁有這么多的次級代謝產(chǎn)物合成基因極有可能是該菌株產(chǎn)生多種生物抗菌活性物質(zhì)的主要原因；通過GO數(shù)據(jù)庫的比對，代謝過程、膜、催化活性等注釋結(jié)果呈現(xiàn)出較高的相關(guān)性；利用KEGG數(shù)據(jù)庫中的代謝通路分析手段，確定了菌株主要代謝通路的組成，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與鏈霉素、青霉素和四環(huán)素產(chǎn)生等代謝通路相關(guān)的基因。根據(jù)這些信息，初步推測該菌株具有一定的抗生素代謝功能，為今后該菌株代謝功能，生物防治功能的探究奠定了基礎(chǔ)。

圖 4 菌株JK7-2 的GO功能歸類Figure 4 GO functional classification of strain JK7-2

圖 5 菌株JK7-2 的KEGG功能歸類Figure 5 KEGG functional classification of strain JK7-2

抗生素是非常重要的一類來源于微生物次級代謝產(chǎn)物的藥物。農(nóng)用抗生素不僅可直接開發(fā)作為農(nóng)藥防治農(nóng)作物的病蟲草害，而且還為化學(xué)農(nóng)藥的創(chuàng)制提供了先導(dǎo)化合物[25]。鏈霉菌屬是公認(rèn)的抗生素和次級代謝產(chǎn)物主要來源，本研究通過對JK7-2基因進(jìn)行預(yù)測，獲得了多個(gè)抗生素和次級代謝產(chǎn)物合成基因，為相關(guān)化合物的合成機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)。

本研究從巨菌草內(nèi)分離出了一株內(nèi)生菌JK7-2，通過形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)及16S rDNA序列分析結(jié)果將其鑒定為鏈霉菌，通過發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)得知，該菌株對玉米小斑病菌有良好的抑制作用，這對開發(fā)新型綠色安全的抗微生物制劑和生物農(nóng)藥具有重要意義。本研究的相關(guān)結(jié)果將為Streptomycessp. JK7-2 的功能基因組學(xué)研究及相關(guān)次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑研究提供幫助；同時(shí)從分子生物學(xué)的角度初步探究了該菌株的生長代謝及抑菌功能機(jī)制，為今后巨菌草內(nèi)生鏈霉菌生物防治相關(guān)機(jī)制研究的深入開展提供了重要的數(shù)據(jù)參考。